Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6662:2000 (ISO 10260 : 1992) về chất lượng nước – Đo thông số sinh hoá – Phương pháp đo phổ xác định nồng độ clorophyl-a do Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường ban hành

TIÊU CHUẨN VIỆT\r\nNAM

\r\n\r\n

TCVN 6662\r\n: 2000

\r\n\r\n

ISO10260\r\n: 1992

\r\n\r\n

CHẤT\r\nLƯỢNG NƯỚC - ĐO THÔNG SỐ SINH HOÁ - PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ\r\nCLOROPHYL-A
\r\nWater quality - Measurement of biochemical parameters - Spectrometric\r\ndetermination of the chlorophyll-a concentration

\r\n\r\n

Lời nói đầu

\r\n\r\n

TCVN 6662 : 2000 hoàn toàn tương đương với\r\nISO 10260 : 1992 . TCVN 6662 : 2000 do Ban Kỹ thuật Tiêu chuẩn TCVN/TC 147

\r\n\r\n

Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu\r\nchuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành.

\r\n\r\n

CHẤT LƯỢNG NƯỚC - ĐO THÔNG SỐ SINH HÓA\r\n- PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CLOROPHYL-A

\r\n\r\n

Water quality - Measurement\r\nof biochemical parameters - Spectrometric determination of the chlorophyll-a\r\nconcentration

\r\n\r\n

1 Phạm vi áp dụng

\r\n\r\n

1.1 Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác\r\nđịnh nồng độ clorophyl-a. Phương pháp này có thể áp dụng cho thực vật phù du\r\ntrong nước mặt tự nhiên và để thử sự tăng trưởng của tảo trong thử nghiệm sinh\r\nhọc. Dùng cách lấy mẫu thích hợp, phương pháp có thể áp dụng cho các thực vật\r\nđáy  (phụ lục A).

\r\n\r\n

1.2 Các picment tảo khác như clorophyl-b ,\r\nclorophyl-c và một vài chất chuyển hoá clorophyl không được xác định. Các\r\npicment nâu (phaeopicment) có thể được xác định bán định lượng để hiệu chỉnh\r\ncản trở khi xác định clorophyl-a và để chỉ ra phần sinh khối tảo không hoạt\r\nhóa.

\r\n\r\n

1.3 Clorophyl nhạy với ánh sáng và oxi, nhất\r\nlà khi bị chiết. Để tránh phân hủy do oxi hóa và quang hóa, không được để mẫu\r\nra không khí hoặc ánh sáng mạnh. Đồng nhất mẫu trong một số trường hợp có thể\r\nlàm tăng hiệu suất chiết.

\r\n\r\n

1.4 Phương pháp chiết bằng etanol gồm việc\r\nđun nóng 75 ^oC trong 5 min để ức chế men clorophylaza và để thúc đẩy\r\nsự phân giải picment. Bảo quản phần chiết (không lọc) trước khi đo phổ trong\r\nthời gian ngắn, có thể đến ba ngày trong tủ lạnh ở 4 ^oC. Bảo quản\r\nphần chiết dưới - 25 ^oC có thể đến ba mươi ngày.

\r\n\r\n

1.5 Mặc dầu suốt quy trình có sử dụng lọc\r\nhoặc ly tâm để làm cho phần chiết cuối cùng trong nhưng nó vẫn có thể bị đục\r\nnhẹ. Sự axit hóa có thể cũng gây đục. Do đó độ hấp thụ đo ở 665 nm cần được\r\nhiệu chỉnh độ đục bằng cách trừ độ hấp thụ đo ở 750 nm.

\r\n\r\n

1.6 Picment của một vài khuẩn ưa sáng (thí dụ\r\nClorobium) cản trở xác định nồng độ clorophyl-a  [1]. Độ hấp thụ của\r\nclorophyl-b và clorophyl-c ở 665 nm rất nhỏ, có thể bỏ qua [2].

\r\n\r\n

2 Tiêu chuẩn trích\r\ndẫn

\r\n\r\n

ISO 5667-1:1980, Chất lượng nước - Lấy mẫu - Phần\r\n1: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu.

\r\n\r\n

TCVN 5992: 1995 (ISO 5667-2:1991), Chất lượng\r\nnước - Lấy mẫu - Hướng dẫn kĩ thuật lấy mẫu.

\r\n\r\n

3 Nguyên tắc

\r\n\r\n

Lấy tảo và chất lơ lửng trong mẫu nước bằng\r\nlọc. Chiết picment tảo từ phần còn lại của quá trình lọc vào etanol nóng. Đo\r\nphổ xác định nồng độ clorophyl-a trong phần chiết. Đánh giá nồng độ clorophyl-a\r\nvà picment nâu từ sự khác nhau của độ hấp thụ ở 665 nm trước và sau khi axit\r\nhóa phần chiết [3] [4].

\r\n\r\n

4 Thuốc thử

\r\n\r\n

Chỉ dùng các thuốc thử tinh khiết phân tích\r\nvà nước đã loại ion hoặc nước tinh khiết tương đương.

\r\n\r\n

4.1 Axit clohydric, c(HCl) = 3 mol/l.

\r\n\r\n

4.2 Etanol, (C₂H₅OH),\r\ndung dịch nước 90 % (V/V).

\r\n\r\n

Chú thích 1 - Phần bị biến chất trong etanol\r\nkhông cản trở phép xác định. Tuy nhiên, nên xác định so sánh bằng etanol tinh\r\nkhiết (90 %) làm nền với mỗi lô mẫu mới [4].

\r\n\r\n

5 Thiết bị, dụng cụ

\r\n\r\n

Các thiết bị, dụng cụ thông thường trong\r\nphòng thí nghiệm và:

\r\n\r\n

5.1 Máy đo phổ, dùng ở vùng khả kiến đến 750\r\nnm, với độ phân giải 1 nm, chiều rộng dải nhỏ hơn 2 nm, độ nhạy nhỏ hơn hoặc\r\nbằng 0,001 đơn vị độ hấp thụ, có các cuvet nằm trong khoảng 1 cm đến 5 cm.

\r\n\r\n

5.2 Thiết bị lọc chân không, có giá và kẹp.

\r\n\r\n

5.3 Cái lọc bằng sợi thủy tinh không có chất\r\nhữu cơ, để lọc mẫu nước và giữ lại hơn 99 % các hạt lớn hơn 1 àm. Dải đường\r\nkính cái lọc thích hợp từ 25 mm đến 50 mm.

\r\n\r\n

5.4 Cái lọc phần chiết, mô tả như 5.3 nhưng đường\r\nkính nhỏ hơn, thí dụ 25 mm.

\r\n\r\n

Cách khác: ly tâm, gia tốc 6 000 g và mâm\r\nquay phù hợp cho các ống nghiệm chiết.

\r\n\r\n

5.5 Nồi cách thủy, điều chỉnh được ở 75 oC +\r\n1 oC có chỗ vừa cho bình chiết.

\r\n\r\n

5.6 Bình chiết, thí dụ các lọ nhỏ màu nâu,\r\nmiệng rộng, có nút vặn bằng polytetrafloetylen  (PTFE), dung tích từ 30 ml đến\r\n50 ml, thích hợp cho việc ly tâm ở 6000 g.

\r\n\r\n

6 Lấy mẫu và bảo quản\r\nmẫu

\r\n\r\n

Lấy mẫu theo ISO 5667-1 và TCVN 5992: 1995\r\n(ISO 5667-2). Có thể bảo quản mẫu trong tủ lạnh, không quá 8 h, nhưng nên\r\ntránh. Nếu có thể, thực hiện 7.1 đến 7.3 ngay sau khi lấy mẫu. Nếu cần, giữ\r\nphần chiết thô trong bình chiết thuỷ tinh màu nâu kín khí (5.6) ở dưới - 25 oC\r\nthì được ba mươi ngày. Không giữ lại mẫu nước đông lạnh hoặc cái lọc có chất\r\nrắn.

\r\n\r\n

7 Cách tiến hành

\r\n\r\n

7.1 Lọc

\r\n\r\n

Lắc để trộn kỹ mẫu. Lọc một thể tích mẫu V_s\r\n(thường khoảng 0,1 đến 2 lit, phụ thuộc vào chiết tảo) qua cái lọc bằng sợi\r\nthủy tinh (5.3) gắn trên giá. Làm khô cái lọc trong chân không, và khi vừa khô thì\r\nlấy khỏi giá đỡ và đặt vào bình chiết. Nếu cái lọc không vừa bình chiết thì cắt\r\ncái lọc thành từng mảnh nhỏ.

\r\n\r\n

Tránh chạm ngón tay vào mẫu.

\r\n\r\n

7.2 Phương án chiết A

\r\n\r\n

Đun nóng một thể tích etanol (4.2) đến 75 ^oC.

\r\n\r\n

Rót một thể tích nhỏ etanol nóng (30 ml đến\r\n40 ml) vào bình chứa cái lọc hoặc mảnh của nó. Để nguội vài phút, nghiền cái\r\nlọc để dễ chiết, nên dùng máy làm đồng nhất có con khuấy dạng que.

\r\n\r\n

Rửa que khuấy bằng một ít etanol (4.2) để\r\nloại mảnh vụn bám vào đó. Chiết phần huyền phù trong ít nhất 3 min.

\r\n\r\n

Chú thích 2 - Việc chiết thường được thực\r\nhiện ở nhiệt độ phòng nhiều giờ hoặc qua đêm. Nếu chiết kéo dài hoặc phần chiết\r\nđược lưu giữ nhiều ngày (thí dụ qua cuối tuần) thì bình chiết cần để trong tủ\r\nlạnh.

\r\n\r\n

Lọc dung dịch qua cái lọc dày (5.4) vào bình\r\nđịnh mức (dung tích 50 ml hoặc 100 ml) có nút. Rửa bình chiết bằng etanol (4.2)\r\nvà chuyển định lượng vào bình định mức. Định mức đến vạch, đậy kín và lắc đều.\r\nĐó là thể tích phần chiết V_e.

\r\n\r\n

Làm tiếp với bước 7.4.

\r\n\r\n

7.3 Phương án chiết B

\r\n\r\n

Lấy chính xác một thể tích V_E (20\r\nml hoặc 25 ml) etanol (4.2) vào bình chiết (5.6) để ngập hết cái lọc. Đóng nắp\r\nchặt để tránh phần chiết bay hơi. Lắc nhẹ để ổn định phần cặn. Đặt vào nồi cách\r\nthủy để phần chiết trong bình ngang mức với nước trong nồi. Đun 5 min, lắc nhẹ\r\nnếu cần. Lấy bình chiết ra khỏi nồi và để nguội đến nhiệt độ phòng trong 15\r\nmin.

\r\n\r\n

Thời gian giữa chiết và đo phải là tối thiểu.

\r\n\r\n

Chú thích 3 - Phần chiết ở giai đoạn này có\r\nthể giữ trong tủ lạnh qua đêm trước khi đo (xem 7.4). Không lưu giữ quá ba\r\nngày.

\r\n\r\n

Lọc phần trong của phần chiết qua cái lọc\r\n(5.4), hứng vào bình phản ứng sạch (5.6), bình này không được tráng bằng dung\r\nmôi (xem chú thích 4).

\r\n\r\n

Có thể ly tâm bình phản ứng để thu được phần\r\ntrong. Dùng phần chiết trong để đo quang.

\r\n\r\n

Chú thích 4 - Khi dùng phương pháp này, chỉ\r\ncần thu lấy một phần thể tích chiết vì thể tích Ve đã biết chính xác và không\r\nmất do bay hơi do đã nút kín. Ngoài ra, nước ở trong cái lọc có thể bỏ qua (xem\r\n7.1) vì nó chỉ nhỏ hơn 5 % thể tích chiết.

\r\n\r\n

7.4 Đo quang

\r\n\r\n

7.4.1 Dùng pipét chuyển một phần chiết trong\r\nvào cuvet của máy đo phổ, để lại một ít đủ cho bước axit hóa (xem 7.4.2).

\r\n\r\n

Đo độ hấp thụ ở 665 nm (A665) và 750 nm\r\n(A750) so với etanol (4.2).

\r\n\r\n

Chú thích 5 - Độ hấp thụ ở 665 nm phải nằm\r\ntrong khoảng 0,01 đến 0,8 đơn vị. Điều đó có thể đạt

\r\n\r\n

được nhờ lấy phần thể tích đã lọc, thể tích\r\nchiết, pha loãng, cu vet ... phù hợp. Để bắt đầu, lấy 0,5

\r\n\r\n

lit mẫu, cái lọc đường kính 50 mm, 20 ml\r\netanol và cuvet 5 cm.

\r\n\r\n

7.4.2 Axit hóa phần chiết (thường là 5 ml đến\r\n10 ml) bằng 0,01 ml axit clohydric (4.1) cho 10 ml phần chiết, lắc và đo độ hấp\r\nthụ ở 665 nm và 750 nm sau 5 min đến 30 min.

\r\n\r\n

8 Tính toán và biểu\r\nthị kết quả

\r\n\r\n

8.1 Nồng độ ρ_c của clorophyl-a, được\r\ntính bằng microgam trên lit, theo công thức:

\r\n\r\n

\r\n\r\n

trong đó

\r\n\r\n

A = A₆₆₅ - A₇₅₀                là\r\nđộ hấp thụ của phần chiết trước khi axit hóa (xem 7.4.1);

\r\n\r\n

A_a = A₆₆₅ - A₇₅₀               là\r\nđộ hấp thụ của phần chiết sau khi axit hóa;

\r\n\r\n

V_e                                 là\r\nthể tích phần chiết, tính bằng mililit;

\r\n\r\n

V_s                                 là\r\nthể tích mẫu đã lọc, tính bằng lit;

\r\n\r\n

K_c = 82 l/μg-cm             là hệ\r\nsố hấp thụ phổ đặc trưng cho clorophyl-a, giá trị này được lấy từ [2];

\r\n\r\n

R = 1,7                         là tỷ số A/A_a\r\ncho dung dịch clorophyl-a tinh khiết bị chuyển thành phaeophytin do axit hóa\r\n(xem 7.4.2) (giá trị này được lấy từ [2]);

\r\n\r\n

d                                  là chiều\r\ndài quang của cuvet, tính bằng centimet;

\r\n\r\n

10³                                là\r\nhệ thập phân số của Ve.

\r\n\r\n

8.2 Nồng độ ρ_p của phaeopicment,\r\ntính bằng microgam trên lit , được tính theo công thức:

\r\n\r\n

\r\n\r\n

8.3 Khi giá trị 82 được lấy cho hệ số hấp thụ\r\nphổ đặc trưng của clorophyl-a trong etanol 90 %, và 1,7 được lấy cho hệ số axit\r\ncực đại (R) của clorophyl-a tinh khiết thì nồng độ clorophyl-a trong mẫu nước được\r\nđơn giản hóa thành

\r\n\r\n

\r\n\r\n

và nồng độ phaeopicment từ công thức (2) được\r\nđơn giản hóa thành công thức (4):

\r\n\r\n

\r\n\r\n

Chú thích

\r\n\r\n

6 Giá trị tính toán của phaeopigment không ổn\r\nđịnh như nồng độ clorophyl-a. Một phép thử liên phòng thí nghiệm đã chỉ rõ độ\r\nlệch 5 % đến 11 % đối với clorophyl-a và 6 % đến 46 % đối với phaeopigment.

\r\n\r\n

7 Tỷ số A/Aa là 1,7 nếu chỉ có clorophyl-a\r\ntồn tại trong mẫu, và là 1 nếu sản phẩm phân hủy của clorophyl-a tồn tại trong\r\nmẫu.

\r\n\r\n

Hệ số hấp thụ (82) cho clorophyl-a trong\r\netanol (4.2) được lấy ở [5] ở 665 nm. Giá trị (84) cho ở đây là cho clorophyl-b\r\nvà clorophyl-c. Độ hấp thụ của clorophyl-a ở cùng nồng độ trong axeton cao hơn\r\n2 % đến 3 % trong etanol ở 665 nm [2] [4].

\r\n\r\n

8.4 Ghi kết quả bằng microgam trên lit (hoặc\r\nmiligam trên mét khối) với hai số có nghĩa hoặc một số sau dấu phẩy, thí dụ:

\r\n\r\n

Nồng độ clorophyl-a                      5,5\r\nμg/l

\r\n\r\n

Nồng độ phaeopigment                 < 0,1\r\nμg/l

\r\n\r\n

9 Độ chính xác

\r\n\r\n

Một phép thử liên phòng thí nghiệm thực hiện\r\n1983 cho kết quả [6] ghi trong bảng 1.

\r\n\r\n

Bảng 1 - Độ chính xác

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n\r\n

\r\n\r\n

10 Báo cáo kết quả

\r\n\r\n

Báo cáo kết quả cần gồm những thông tin sau:

\r\n\r\n

a) viện dẫn tiêu chuẩn này;

\r\n\r\n

b) nhận biết mẫu nước;

\r\n\r\n

c) biểu diễn kết quả, theo điều 8;

\r\n\r\n

d) xử lý mẫu trước, nếu có;

\r\n\r\n

e) những sai khác so với phương pháp này hoặc\r\nmọi tình huống có thể ảnh hưởng đến kết quả.

\r\n\r\n
\r\n\r\n\r\n

Phụ\r\nlục A

\r\n\r\n

(tham khảo)

\r\n\r\n

XÁC\r\nĐỊNH HÀM LƯỢNG THỰC VẬT ĐÁY

\r\n\r\n

A.1 Xác định thực vật đáy

\r\n\r\n

Lấy mẫu thực vật phù du theo ISO 5667-1 và\r\nTCVN 5992: 1995 (ISO 5667-2).

\r\n\r\n

Lấy mẫu thực vật đáy (tảo bám vào) phụ thuộc\r\nvào chất nền. Một vùng diện tích bề mặt xác định trên đá hoặc trên vật liệu\r\nkhác chìm trong nước có thể được nạo ra bằng dao hoặc lưỡi dao cạo râu.

\r\n\r\n

Sỏi và đá nhỏ lấy trực tiếp vào dung môi. Vật\r\nliệu nhân tạo đặt xuống nước như một miếng thủy tinh làm cho việc lấy mẫu trở\r\nnên dễ dàng. Cả miếng thủy tinh hoặc tảo được lấy ra và vận chuyển từ nơi lấy\r\nmẫu cùng với nước. Tảo đáy hoặc chất nền với khối lượng đã biết sẽ được xử lý tương\r\ntự như với thực vật phù du theo phương pháp mô tả ở tiêu chuẩn này.

\r\n\r\n

A.2 Dung môi chiết

\r\n\r\n

Axeton được dùng nhiều vì nó được UNESCO-SCOR\r\nđề nghị vào năm 1966 để chiết tảo. Tuy nhiên, trong một số trường hợp axeton tỏ\r\nra không được tốt nên được thay bằng cồn. Thực nghiệm đã chỉ ra rằng etanol và\r\nmetanol nóng là tương tự nhau và chiết tốt hơn axeton lạnh [4]. Nhưng nếu axit hóa\r\nphần chiết để hiệu chỉnh ảnh hưởng của phaeopicment thì sinh ra vấn đề. Sự lệch\r\ncủa độ hấp thụ cực đại về phía các sóng ngắn hơn có thể dẫn đến sự thay đổi tỷ\r\nsố axit, thí dụ nồng độ axit, hàm lượng nước trong dung môi và cái lọc, thời\r\ngian từ lúc axit hóa đến lúc đo. Những vấn đề này chỉ có thể khắc phục bằng\r\ncách thêm các bước trong phương pháp, thí dụ trung hòa bằng bazơ hữu cơ\r\n(dimetyl anilin hoặc diphenyl anilin). Ngoài ra, mêtanol rất độc. Vì thế,\r\nkhuyến nghị dùng etanol làm chất chiết để xác định clophyl-a trong mẫu nước\r\nngọt và nước biển.

\r\n\r\n
\r\n\r\n\r\n

Phụ\r\nlục B

\r\n\r\n

(tham khảo)

\r\n\r\n

TÀI\r\nLIỆU THAM KHẢO

\r\n\r\n

[1] TOLSTOY, A. và TOTH, I., Bacterio\r\nclorophyl-d và ảnh hưởng của nó đến xác định clorophyl-a, Arch. Hydro biol.89\r\n(1980), tr 160 - 170.

\r\n\r\n

Bacterio clorophyl-d and its interference on\r\ndetermination of chlorophyll-a Arch. Hydro biol.

\r\n\r\n

89 (1980),pp.160-170

\r\n\r\n

 [2] NUSCH, E.A., So sánh các phương pháp\r\nkhác nhau để xác định clorophyl và phaeopigment, Arch.\r\nHydrobiol.Ergebn.Limnol.14 (1980). tr 14-36.

\r\n\r\n

Comparison of different methods for chlorophyll\r\nand phaeopigment determination, Arch.

\r\n\r\n

Hydrobiol.Ergebn.Limnol.14 (1980), pp. 14-36

\r\n\r\n

[3] LORENZEN, C. J., Xác định clorophyll và\r\nphaeopigment, phương trình trắc quang, Limmol.

\r\n\r\n

oceanogr.12 (1967), tr. 343-346.

\r\n\r\n

Determination of chlorophyll and phaeopigments;\r\nspectrophotometric equations, Limmol.

\r\n\r\n

oceanogr.12 (1967), pp. 343-346.

\r\n\r\n

 [4] MARKER, A.F.H., NUSCH, E.A, RAI, H. và\r\nRIEMANN, B. Đo các pigment quang hợp trong nước ngọt và những phương pháp tiêu\r\nchuẩn hóa: kết luận và đề nghị, Arch. Hydrobiol Beich.

\r\n\r\n

Ergebn.Limnol, 14 (1980) tr. 91-106.

\r\n\r\n

The mesurement of photosynthetic pigments in\r\nfrestwaters and standardization of methods:

\r\n\r\n

Conclusions and recommentdations. Arch.\r\nHydrobiol Beich. Ergebn.Limnol, 14 (1980) pp. 91-106.

\r\n\r\n

 [5] VOLLENWEIDER, R.A, Những phương pháp đo\r\ndự phát triển trong môi trường nước. IBP

\r\n\r\n

Handbook No12, xuất bản lần thứ hai (1971)\r\nBlackwell Scient Publ.Oxford. Edinburgh.

\r\n\r\n

A manual on methods of measuring primary\r\nproduction in aquatic environments, IBP Handbook No 12, 2nd ed. (1971)\r\nBlackwell Scient Publ.Oxford. Edinburgh.

\r\n\r\n

 [6] NISCH, E.A., những kết quả thử liên\r\nphòng thí nghiệm . Xác định clorophyl-a.Z. Wasser Abw.Forsch.17, (1984), tr\r\n189-194.

\r\n\r\n

Results from an interlaboratory ring test\r\nconcerning the determination of chlorophyll a. Z. Wasser Abw.Forsch.17, (1984),\r\npp. 189-194.

\r\n\r\n