Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp phát hiện và định lượng enterobacteriaceae – Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc

\r\n\r\n

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

\r\n\r\n

TCVN 5518-2:2007

\r\n\r\n

ISO 21528-2:2004

\r\n\r\n

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI -\r\nPHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE - PHẦN 2: KỸ THUẬT ĐẾM\r\nKHUẨN LẠC

\r\n\r\n

Microbiology\r\nof food and animal feeding stuffs - Horizontal methods for the detection and\r\nenumeration of Enterobacteriaceae - Part 2: Colony-count method

\r\n\r\n

Lời nói đầu

\r\n\r\n

TCVN 5518-2:2007 cùng với TCVN\r\n5518-1:2007 thay thế TCVN 5518-91, TCVN 6847:2001 (ISO 7402:1993) và TCVN\r\n7136:2002 (ISO 5552:1997);

\r\n\r\n

TCVN 5518-2:2007 hoàn toàn tương\r\nđương với ISO 21528-2:2004;

\r\n\r\n

TCVN 5518-2:2007 do Ban kỹ thuật\r\ntiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng\r\ncục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

\r\n\r\n

TCVN 5518:2007 Vi sinh vật trong thực\r\nphẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp phát hiện và định lượng\r\nEnterobacteriaceae, bao gồm các phần sau:

\r\n\r\n

- Phần 1: Phát hiện và định lượng\r\nbằng kỹ thuật MPN có tiền tăng sinh;

\r\n\r\n

- Phần 2: Kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

\r\n\r\n

Lời giới thiệu

\r\n\r\n

Tiêu chuẩn này đưa ra hướng dẫn\r\nchung để kiểm tra các sản phẩm không được đề cập đến trong các tiêu chuẩn hiện\r\nhành và được xem xét bởi các tổ chức chuẩn bị các phương pháp thử vi sinh vật\r\nđể áp dụng cho thực phẩm hoặc thức ăn chăn nuôi. Do tính đa đạng của thực phẩm\r\nvà thức ăn chăn nuôi trong lĩnh vực áp dụng nên phương pháp này có thể không\r\nthích hợp đến từng chi tiết cho từng sản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có\r\nthể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng cho từng sản phẩm, nếu hoàn toàn chỉ\r\nvì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương pháp này khi có thể.

\r\n\r\n

Khi tiêu chuẩn này được soát xét\r\nthì cần phải tính đến mọi thông tin liên quan đến phạm vi mà các hướng dẫn này\r\nphải tuân theo và các nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trong trường\r\nhợp các sản phẩm cụ thể.

\r\n\r\n

Việc hài hòa các phương pháp thử có\r\nthể không thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại\r\ncác tiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu\r\nchuẩn này. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử\r\nnghiệm thì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Thông thường khi các tiêu chuẩn như\r\nvậy được soát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này,\r\nsao cho cuối cùng chỉ còn các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này là các lý do\r\nkỹ thuật được thừa nhận.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

VI\r\nSINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH\r\nLƯỢNG ENTEROBACTERIACEAE - PHẦN 2: KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC

\r\n\r\n

Microbiology\r\nof food and animal feeding stuffs - Horizontal methods for the detection and\r\nenumeration of Enterobacteriaceae - Part 2: Colony-count method

\r\n\r\n

1. Phạm vi áp\r\ndụng

\r\n\r\n

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp\r\nđịnh lượng Enterobacteriaceae mà không cần phải qua giai đoạn tiền tăng sinh.\r\nPhương pháp này có thể áp dụng cho:

\r\n\r\n

- các sản phẩm thực phẩm và thức ăn\r\nchăn nuôi và

\r\n\r\n

- các mẫu môi trường trong khu vực\r\nsản xuất và chế biến thực phẩm.

\r\n\r\n

Việc định lượng được thực hiện bằng\r\nphương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc sau khi ủ ấm ở 37^oC\r\n(hoặc 30^oC) 1).

\r\n\r\n

Khi số lượng khuẩn lạc dự kiến có\r\nmặt nhiều hơn 100 trong một mililít hoặc một gam mẫu thử, thì nên dùng kỹ thuật\r\nnày.

\r\n\r\n

2. Tài liệu\r\nviện dẫn

\r\n\r\n

Các tài liệu viện dẫn sau là rất\r\ncần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi\r\nnăm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn\r\nkhông ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

\r\n\r\n

TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản\r\nphẩm sữa - Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung\r\ndịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh.

\r\n\r\n

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật\r\ntrong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung về kiểm tra vi\r\nsinh vật.

\r\n\r\n

TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), Vi sinh\r\nvật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu\r\nvà các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các\r\nnguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập\r\nphân.

\r\n\r\n

TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), Vi sinh\r\nvật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu\r\nvà các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 2: Các\r\nnguyên tắc cụ thể để chuẩn bị thịt và sản phẩm thịt.

\r\n\r\n

TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), Vi sinh\r\nvật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu\r\nvà các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 3: Các\r\nnguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản.

\r\n\r\n

TCVN 6507-4 (ISO 6887-4), Vi sinh\r\nvật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu\r\nvà các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 4: Các\r\nnguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các sản phẩm khác với sữa và sản phẩm sữa, thịt\r\nvà sản phẩm thịt, thủy sản và sản phẩm thủy sản.

\r\n\r\n

ISO/TS 11133-1, Microbiology of\r\nfood and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of\r\nculture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the\r\npreparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật trong thực phẩm và\r\nthức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy - Phần 1: Các\r\nhướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường cấy trong\r\nphòng thử nghiệm).

\r\n\r\n

ISO/TS 11133-2 : 2003, Microbiology\r\nof food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of\r\nculture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture\r\nmedia (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn bị và\r\ntạo môi trường cấy - Phần 2: Các hướng dẫn thực hành về thử tính năng của môi\r\ntrường cấy).

\r\n\r\n

3. Thuật ngữ và\r\nđịnh nghĩa

\r\n\r\n

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các\r\nthuật ngữ và định nghĩa sau đây:

\r\n\r\n

3.1. Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae)

\r\n\r\n

Vi sinh vật hình thành các khuẩn\r\nlạc đặc trưng trên thạch glucoza mật đỏ tím và lên men glucoza và cho phản ứng\r\noxidaza âm tính khi tiến hành phép thử theo phương pháp qui định trong tiêu\r\nchuẩn này.

\r\n\r\n

3.2. Số đếm Enterobacteriaceae (count\r\nof Enterobacteriaceae)

\r\n\r\n

Số lượng Enterobacteriaceae tìm\r\nthấy trong một mililit hoặc một gam mẫu thử, khi tiến hành thử theo phương pháp\r\nqui định trong tiêu chuẩn này.

\r\n\r\n

4. Nguyên tắc

\r\n\r\n

4.1. Chuẩn bị huyền phù ban đầu\r\nvà các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo

\r\n\r\n

Từ mẫu thử chuẩn bị huyền phù ban\r\nđầu và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo.

\r\n\r\n

4.2. Phân lập

\r\n\r\n

Cấy một lượng xác định của mẫu thử\r\nnếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác, vào\r\nhai đĩa Petri (dùng kỹ thuật đổ đĩa) chứa thạch glucoza mật đỏ tím. Phủ lên\r\ntrên bằng một lớp môi trường thạch này.

\r\n\r\n

Chuẩn bị các cặp đĩa thạch khác\r\ntrong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử\r\nhoặc của huyền phù ban đầu.

\r\n\r\n

Ủ các đĩa thạch này ở 37^oC\r\n(hoặc 30^oC) trong 24 h ± 2 h.

\r\n\r\n

4.3. Khẳng định

\r\n\r\n

Các khuẩn lạc Enterobacteriaceae\r\ngiả định được cấy truyền lên môi trường không chọn lọc và khẳng định bằng các\r\nphép thử lên men glucoza và kiểm tra sự có mặt của oxidaza.

\r\n\r\n

4.4. Tính toán

\r\n\r\n

Tính số lượng Enterobacteriaceae có\r\ntrong một mililit hoặc trong một gam mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc điển hình đã\r\nkhẳng định trên mỗi đĩa.

\r\n\r\n

5. Dịch pha\r\nloãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử

\r\n\r\n

Về thực hành trong phòng thử nghiệm\r\nhiện hành, xem TCVN 6404 (ISO 7218), ISO/TS 11133-1 và ISO/TS 11133-2.

\r\n\r\n

5.1. Dịch pha loãng

\r\n\r\n

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1).

\r\n\r\n

5.2. Môi trường nuôi cấy

\r\n\r\n

5.2.1. Thạch glucoza mật đỏ tím\r\n(VRBG)

\r\n\r\n

5.2.1.1. Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Dịch thủy phân mô động vật bằng\r\n enzym \r\n	\r\n 7,0\r\n g \r\n
\r\n Cao nấm men \r\n	\r\n 3,0\r\n g \r\n
\r\n Muối mật No.3 \r\n	\r\n 1,5\r\n g \r\n
\r\n Glucoza \r\n	\r\n 10,0\r\n g \r\n
\r\n Natri clorua \r\n	\r\n 5,0\r\n g \r\n
\r\n Đỏ trung tính \r\n	\r\n 0,03\r\n g \r\n
\r\n Tím tinh thể (crystal violet) \r\n	\r\n 0,002\r\n g \r\n
\r\n Thạch \r\n	\r\n 9 g\r\n đến 18 g a) \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 1\r\n 000 ml \r\n
\r\n a) Phụ thuộc\r\n sức đông của thạch \r\n

\r\n\r\n

5.2.1.2. Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hòa tan các thành phần hoặc môi\r\ntrường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi.

\r\n\r\n

Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi là\r\n7,4 ± 0,2 ở 25^oC, nếu cần.

\r\n\r\n

Phân phối môi trường nuôi cấy này\r\nvào các ống nghiệm hoặc bình vô trùng (6.5) có dung tích không lớn hơn 500 ml.

\r\n\r\n

Không khử trùng môi trường.

\r\n\r\n

Chuẩn bị môi trường này ngay trước\r\nkhi sử dụng. Môi trường nấu chảy được dùng trong vòng 4 h.

\r\n\r\n

5.2.1.3. Kiểm tra chất lượng môi\r\ntrường nuôi cấy

\r\n\r\n

Đối với việc xác định tính chọn lọc\r\nvà hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem ISO/TS\r\n11133-2:2003, Bảng B.1.

\r\n\r\n

5.2.2. Thạch dinh dưỡng

\r\n\r\n

5.2.2.1. Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Cao thịt \r\n	\r\n 3,0\r\n g \r\n
\r\n Dịch thủy phân mô động vật bằng\r\n enzym \r\n	\r\n 5,0\r\n g \r\n
\r\n Natri clorua \r\n	\r\n 5,0\r\n g \r\n
\r\n Thạch \r\n	\r\n 9 g\r\n đến 18 ga) \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 1\r\n 000 ml \r\n
\r\n a) Phụ thuộc\r\n sức đông của thạch \r\n

\r\n\r\n

5.2.2.2. Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hòa tan các thành phần hoặc môi\r\ntrường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

\r\n\r\n

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng\r\nlà 7,3 ± 0,2 ở 25^oC, nếu cần.

\r\n\r\n

Phân phối môi trường nuôi cấy vào\r\ncác ống nghiệm hoặc bình vô trùng (6.5) có dung tích không lớn hơn 500 ml.

\r\n\r\n

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp\r\nlực (6.1) ở 121^oC.

\r\n\r\n

5.2.2.3. Chuẩn bị các đĩa thạch

\r\n\r\n

Chuyển vào mỗi đĩa Petri (6.6)\r\nkhoảng 15 ml môi trường đã được làm tan chảy và làm nguội đến khoảng 47 ^oC\r\nvà để cho đông đặc.

\r\n\r\n

Ngay trước khi sử dụng, làm khô mặt\r\nthạch, và tốt nhất là mở nắp và để bề mặt thạch hướng xuống dưới ở trong tủ ấm\r\n(6.3) cho đến khi bề mặt thạch khô.

\r\n\r\n

Nếu chuẩn bị trước, có thể bảo quản\r\ncác đĩa thạch chưa khô này đến 2 tuần ở 5 ^oC ± 3 ^oC mà\r\nkhông làm thay đổi các thành phần của chúng.

\r\n\r\n

5.2.2.4. Kiểm tra chất lượng môi\r\ntrường nuôi cấy

\r\n\r\n

Đối với việc xác định tính chọn lọc\r\nvà hiệu quả, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các tiêu chí thực hiện, xem ISO/TS\r\n11133-2:2003, Bảng B.6.

\r\n\r\n

5.2.3. Thạch glucoza

\r\n\r\n

5.2.3.1. Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Dịch thủy phân casein bằng enzym \r\n	\r\n 10,0\r\n g \r\n
\r\n Cao nấm men \r\n	\r\n 1,5\r\n g \r\n
\r\n Glucoza \r\n	\r\n 10,0\r\n g \r\n
\r\n Natri clorua \r\n	\r\n 5,0\r\n g \r\n
\r\n Bromcresol tía \r\n	\r\n 0,015\r\n g \r\n
\r\n Thạch \r\n	\r\n 9 g\r\n đến 18 ga) \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 1\r\n 000 ml \r\n
\r\n a) Phụ thuộc\r\n sức đông của thạch \r\n

\r\n\r\n

5.2.3.2. Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hòa tan các thành phần hoặc môi\r\ntrường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

\r\n\r\n

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng\r\nlà 7,0 ± 0,2 ở 25^oC, nếu cần.

\r\n\r\n

Phân phối môi trường nuôi cấy vào\r\ncác ống nghiệm hoặc bình cầu vô trùng (6.5) có dung tích thích hợp.

\r\n\r\n

Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp\r\nlực (6.1) ở 121^oC. Để các ống theo phương thẳng đứng.

\r\n\r\n

Môi trường này có thể bảo quản đến\r\n1 tuần ở 5 ^oC ± 3 ^oC.

\r\n\r\n

Ngay trước khi sử dụng, làm nóng\r\nmôi trường trong nước sôi hoặc luồng hơi nước trong 15 min, sau đó nhanh chóng\r\nlàm nguội đến nhiệt độ ủ ấm.

\r\n\r\n

5.3. Thuốc thử oxidaza

\r\n\r\n

5.3.1. Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n N,N,N'N' - Tetrametyl-r-phenylendiamin dihydroclorua \r\n	\r\n 1,0\r\n g \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 100\r\n ml \r\n

\r\n\r\n

5.3.2. Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hòa tan thành phần trên trong nước\r\nlạnh.

\r\n\r\n

Chuẩn bị thuốc thử ngay trước khi\r\nsử dụng.

\r\n\r\n

Có thể sử dụng các đĩa hoặc que thử\r\ncó bán sẵn. Trong trường hợp này, cần theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

\r\n\r\n

6. Thiết bị và\r\ndụng cụ thủy tinh

\r\n\r\n

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng\r\nthử nghiệm vi sinh thông thường và cụ thể như sau [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

\r\n\r\n

6.1. Thiết bị để khử trùng khô (tủ\r\nsấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

\r\n\r\n

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

\r\n\r\n

6.2. Tủ ấm, có khả năng hoạt\r\nđộng ở 37^oC ± 1^oC.

\r\n\r\n

6.3. Tủ sấy (được đối lưu\r\nkhông khí) hoặc tủ ấm, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 37^oC\r\nđến 55^oC.

\r\n\r\n

6.4. Nồi cách thủy, hoặc\r\nthiết bị tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 44^oC đến 47^oC.

\r\n\r\n

6.5. Dụng cụ chứa, (ví dụ:\r\nống nghiệm) có kích thước khoảng 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm hoặc bình\r\ncầu hoặc chai có dung tích từ 150 ml đến 500 ml, thích hợp cho việc\r\nkhử trùng và bảo quản môi trường cấy.

\r\n\r\n

6.6. Đĩa Petri, bằng thủy\r\ntinh hoặc chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

\r\n\r\n

6.7. Que cấy vòng (đường\r\nkính khoảng 3 mm) và que cấy, bằng platin/iridi hoặc niken/crom, hoặc đũa\r\nthủy tinh, hoặc que cấy vòng hoặc kim cấy vô trùng tương đương sử dụng một\r\nlần.

\r\n\r\n

6.8. Pipet chia độ xả hết, dung\r\ntích danh định 1 ml được chia độ đến 0,1 ml, có lỗ xả với đường kính lỗ từ 2 mm\r\nđến 3 mm.

\r\n\r\n

6.9. Máy đo pH, có độ chính\r\nxác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25^oC.

\r\n\r\n

6.10. Dụng cụ đồng hóa.

\r\n\r\n

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

\r\n\r\n

7. Lấy mẫu

\r\n\r\n

Điều quan trọng là mẫu gửi đến\r\nphòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hay biến đổi trong\r\nquá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

\r\n\r\n

Phương pháp lấy mẫu phải tiến hành\r\ntheo tiêu chuẩn riêng thích hợp với sản phẩm liên quan. Nếu không có tiêu chuẩn\r\nriêng thì các bên liên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

\r\n\r\n

8. Chuẩn bị mẫu\r\nthử

\r\n\r\n

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6507-1\r\n(ISO 6887-1), TCVN 6507-2 (ISO 6887-2), TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), TCVN 6507-4\r\n(ISO 6887-4) hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) và/hoặc các tiêu chuẩn cụ thể thích hợp\r\nvới sản phẩm có liên quan. Nếu không có các tiêu chuẩn cụ thể thì các bên có\r\nliên quan nên thỏa thuận với nhau về vấn đề này.

\r\n\r\n

9. Cách tiến\r\nhành

\r\n\r\n

9.1. Khái quát

\r\n\r\n

Về cách tiến hành, xem TCVN 6404\r\n(ISO 7218).

\r\n\r\n

9.2. Phần mẫu thử, huyền phù ban\r\nđầu và các dung dịch pha loãng tiếp theo

\r\n\r\n

Xem TCVN 6507-1 (ISO 6887-1), TCVN\r\n6507-2 (ISO 6887-2), TCVN 6507-3 (ISO 6887-3), TCVN 6507-4 (ISO 6887-4) và/hoặc\r\nTCVN 6263 (ISO 8261).

\r\n\r\n

Chuẩn bị một dãy các dung dịch pha\r\nloãng từ mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc từ huyền phù ban đầu nếu sản\r\nphẩm ở dạng khác.

\r\n\r\n

9.3. Cấy và ủ

\r\n\r\n

9.3.1. Lấy hai đĩa Petri vô\r\ntrùng (6.6). Dùng một pipet vô trùng (6.8) chuyển vào mỗi đĩa 1 ml mẫu thử nếu\r\nsản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác.

\r\n\r\n

Lấy hai đĩa Petri vô trùng khác. Sử\r\ndụng một pipet vô trùng mới chuyển vào mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng thập\r\nphân thứ nhất (10^-1) của mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng hoặc 1 ml\r\ndung dịch pha loãng thập phân thứ nhất huyền phù ban đầu (10^-2) nếu\r\nsản phẩm ở dạng khác.

\r\n\r\n

Lặp lại qui trình này với các dung\r\ndịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet vô trùng mới cho mỗi độ\r\npha loãng.

\r\n\r\n

9.3.2. Rót vào mỗi đĩa Petri\r\nkhoảng 10 ml môi trường glucoza mật đỏ tím (5.2.1) đã được chuẩn bị rồi làm\r\nnguội đến nhiệt độ từ 44^oC đến 47^oC trên nồi cách thủy\r\n(6.4). Thời gian tính từ khi rót môi trường vào đĩa Petri và cấy không được quá\r\n15 min.

\r\n\r\n

Trộn cẩn thận dịch cấy với môi\r\ntrường bằng chuyển động ngang và để môi trường đông đặc, để các đĩa Petri trên\r\nmặt phẳng, mát.

\r\n\r\n

9.3.3. Sau khi hỗn hợp đông\r\nđặc, phủ lên trên một lớp dày khoảng 15 ml môi trường glucoza mật đỏ tím\r\n(5.2.1), đã được chuẩn bị và làm nguội theo 9.3.2, để ngăn ngừa vi khuẩn mọc\r\nlan rộng và để đảm bảo điều kiện nửa kỵ khí. Để đông đặc lại như mô tả ở trên.

\r\n\r\n

9.3.4. Lật ngược các đĩa\r\nPetri đã chuẩn bị và ủ trong tủ ấm (6.2) để ở 37^oC trong 24 h ± 2 h.

\r\n\r\n

9.4. Đếm và chọn các khuẩn lạc\r\nđể khẳng định

\r\n\r\n

Các khuẩn lạc đặc trưng có màu hồng\r\nđến màu đỏ hoặc đỏ tía (có hoặc không có quầng tủa).

\r\n\r\n

Chọn các đĩa (xem 9.3.4) có chứa ít\r\nhơn 150 khuẩn lạc đặc trưng; đếm các khuẩn lạc này. Chọn ngẫu nhiên năm khuẩn\r\nlạc này cấy truyền (xem 9.5) để thử khẳng định sinh hóa (9.6).

\r\n\r\n

Phép xác định được coi là không có\r\ngiá trị nếu một nửa hoặc nhiều hơn một nửa bề mặt của đĩa bị mọc quá dày. Nếu\r\nít hơn một nửa bề mặt đĩa mọc quá dày thì đếm các khuẩn lạc trên phần mọc rõ và\r\nngoại suy cho số lượng tương ứng với tổng diện tích bề mặt đĩa.

\r\n\r\n

Enterobacteriaceae đích thực có thể\r\nlàm phai màu các khuẩn lạc của chúng hoặc của môi trường. Do đó, khi không có\r\nmặt các khuẩn lạc đặc trưng, thì chọn năm khuẩn lạc hơi trắng để khẳng định.

\r\n\r\n

9.5. Cấy truyền các khuẩn lạc đã\r\nchọn

\r\n\r\n

Ria cấy lên các đĩa thạch dinh\r\ndưỡng (5.2.2) từng khuẩn lạc đã được chọn để thử khẳng định (xem 9.4).

\r\n\r\n

Ủ các đĩa này ở 37^oC\r\ntrong 24 h ± 2 h.

\r\n\r\n

Chọn khuẩn lạc được tách biệt rõ từ\r\ncác đĩa đã ủ ấm để thử khẳng định sinh hóa (xem 9.6).

\r\n\r\n

9.6. Phép thử khẳng định sinh\r\nhóa

\r\n\r\n

9.6.1. Phản ứng oxidaza

\r\n\r\n

Dùng que cấy vòng hoặc que cấy hoặc\r\nđũa thủy tinh (6.7), lấy một phần của mỗi khuẩn lạc được tách biệt rõ (9.5) và\r\nria cấy lên giấy lọc đã được làm ẩm bằng thuốc thử oxidaza (5.3) hoặc lên các\r\nđĩa bán sẵn. Không dùng que cấy vòng hoặc que cấy bằng niken/crom.

\r\n\r\n

Phép thử được coi là âm tính khi\r\nmàu của giấy lọc đó không chuyển sang màu sẫm trong vòng 10 s.

\r\n\r\n

Cần theo hướng dẫn của nhà sản xuất\r\nđối với các đĩa có bán sẵn.

\r\n\r\n

9.6.2. Thử lên men

\r\n\r\n

Dùng que cấy (6.7) lấy cùng một\r\nloại khuẩn lạc đã được chọn trong 9.5 mà cho phép thử oxidaza âm tính cấy đâm\r\nsâu vào các ống chứa thạch glucoza (5.2.3).

\r\n\r\n

Ủ các ống này ở 37^oC\r\ntrong 24 h ± 2 h.

\r\n\r\n

Nếu màu vàng lan rộng khắp ống\r\nthạch, thì phản ứng được coi là dương tính.

\r\n\r\n

9.6.3. Diễn giải các phép thử\r\nsinh hóa

\r\n\r\n

Các khuẩn lạc cho âm tính oxidaza\r\nvà dương tính glucoza được khẳng định là Enterobacteriaceae.

\r\n\r\n

10. Biểu thị\r\nkết quả

\r\n\r\n

Xem TCVN 6404 (ISO 7218).

\r\n\r\n

11. Báo cáo\r\nthử nghiệm

\r\n\r\n

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

\r\n\r\n

- mọi thông tin cần thiết để nhận\r\nbiết đầy đủ về mẫu thử;

\r\n\r\n

- phương pháp lấy mẫu đã sử dụng,\r\nnếu biết;

\r\n\r\n

- phương pháp thử đã sử dụng và\r\nviện dẫn tiêu chuẩn này;

\r\n\r\n

- nhiệt độ ủ ấm đã sử dụng;

\r\n\r\n

- tất cả các chi tiết thao tác\r\nkhông qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác\r\ncó thể ảnh hưởng tới kết quả;

\r\n\r\n

- các kết quả thử nghiệm thu được.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

Phụ lục A

\r\n\r\n

(Qui\r\nđịnh)

\r\n\r\n

Giới hạn tin cậy để ước tính số lượng nhỏ các\r\nkhuẩn lạc

\r\n\r\n

Các giới hạn tin cậy được đưa ra ở\r\nmức xác suất 95% để ước tính số lượng nhỏ các khuẩn lạc, khi số lượng khuẩn lạc\r\nđược giữ lại ít hơn 15, được đưa ra trong Bảng A.1.

\r\n\r\n

Bảng\r\nA.1 - Giới hạn tin cậy để ước tính các khuẩn lạc với số lượng nhỏ

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Số\r\n lượng vi sinh vật \r\n	\r\n Giới\r\n hạn tin cậy ở mức 95% \r\n
	\r\n Dưới \r\n	\r\n Trên \r\n
\r\n 1 \r\n	\r\n <\r\n 1 \r\n	\r\n 2 \r\n
\r\n 2 \r\n	\r\n <\r\n 1 \r\n	\r\n 4 \r\n
\r\n 3 \r\n	\r\n <\r\n 1 \r\n	\r\n 5 \r\n
\r\n 4 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 6 \r\n
\r\n 5 \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 9 \r\n
\r\n 6 \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 10 \r\n
\r\n 7 \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 12 \r\n
\r\n 8 \r\n	\r\n 3 \r\n	\r\n 13 \r\n
\r\n 9 \r\n	\r\n 4 \r\n	\r\n 14 \r\n
\r\n 10 \r\n	\r\n 4 \r\n	\r\n 16 \r\n
\r\n 11 \r\n	\r\n 5 \r\n	\r\n 18 \r\n
\r\n 12 \r\n	\r\n 6 \r\n	\r\n 19 \r\n
\r\n 13 \r\n	\r\n 7 \r\n	\r\n 20 \r\n
\r\n 14 \r\n	\r\n 7 \r\n	\r\n 21 \r\n
\r\n 15 \r\n	\r\n 8 \r\n	\r\n 23 \r\n

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

THƯ\r\nMỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

\r\n\r\n

[1] COWELL. N.D and MORISETTI\r\nM.D.J. Sci. Fd. Agric., 20, 1969, p.573

\r\n\r\n