Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5164:2008 (EN 14122:2003) về thực phẩm – xác định vitamin B1 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

\r\n\r\n

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

\r\n\r\n

TCVN 5164:2008

\r\n\r\n

EN 14122:2003

\r\n\r\n

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₁ BẰNG\r\nSẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

\r\n\r\n

Foodstuffs\r\n– Determination of vitamin B₁ by high performance liquid\r\nchromatography (HPLC)

\r\n\r\n

Lời nói đầu

\r\n\r\n

TCVN 5164:2008 thay thế TCVN 5164:1990;

\r\n\r\n

TCVN 5164:2008 hoàn toàn tương\r\nđương với EN 14122:2003;

\r\n\r\n

TCVN 5164:2008 do Ban kỹ thuật tiêu\r\nchuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn,\r\nTổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công\r\nbố.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

THỰC\r\nPHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

\r\n\r\n

Foodstuffs\r\n– Determination of vitamin B₁ by high performance liquid\r\nchromatography (HPLC)

\r\n\r\n

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu\r\nchuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy\r\nhiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng.\r\nNgười sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp\r\nvà xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu\r\nchuẩn.

\r\n\r\n

1. Phạm vi áp dụng

\r\n\r\n

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp\r\nxác định vitamin B₁ trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao\r\n(HPLC). Hàm lượng vitamin B₁ là khối lượng thiamin tổng số bao gồm\r\ncác dẫn xuất đã tách phospho.

\r\n\r\n

2. Tài liệu\r\nviện dẫn

\r\n\r\n

Các tài liệu viện dẫn sau là rất\r\ncần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm\r\ncông bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi\r\nnăm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

\r\n\r\n

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987),\r\nNước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp\r\nthử.

\r\n\r\n

3. Nguyên tắc

\r\n\r\n

Thiamin được chiết ra khỏi thực\r\nphẩm sau khi thủy phân bằng axit rồi tách phospho sử dụng cách xử lý bằng enzym\r\nvà định lượng bằng HPLC có dẫn xuất sau cột hoặc trước cột với thiocrom [1] đến\r\n[6].

\r\n\r\n

4. Thuốc thử

\r\n\r\n

4.1. Yêu cầu chung

\r\n\r\n

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh\r\nkhiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước ít nhất là loại 1 của TCVN\r\n4851:1989 (ISO 3696:1987) hoặc nước cất hai lần, trừ khi có qui định khác.

\r\n\r\n

4.2. Hóa chất và các dung dịch

\r\n\r\n

4.2.1. Metanol, loại dùng cho\r\nHPLC, w(CH₃OH) ≥ 99,8 % (khối lượng).

\r\n\r\n

4.2.2. Dung dịch axit axetic,\r\nc(CH₃COOH) = 0,02 mol/l.

\r\n\r\n

4.2.3. Isobutanol, w(C₄H₁₀O)\r\n≥ 98%.

\r\n\r\n

4.2.4. Natri dihydro phosphat,\r\nw(NaH₂PO₄) ≥ 99,8%.

\r\n\r\n

4.2.5. Axit clohydric,\r\nw(HCl) = 36%.

\r\n\r\n

4.2.6. Axit clohydric,\r\nc(HCl) = 0,1 mol/l.

\r\n\r\n

4.2.7. Axit sulfuric, c(H₂SO­₄)\r\n= 0,05 mol/l.

\r\n\r\n

4.2.8. Natri hydroxit,\r\nw(NaOH) ≥ 99%.

\r\n\r\n

4.2.9. Dung dịch natri hydroxit,\r\nnồng độ khối lượng ρ(NaOH) = 150 g/l.

\r\n\r\n

4.2.10. Dung dịch natri hydroxit,\r\nρ(NaOH) = 200 g/l.

\r\n\r\n

4.2.11. Kali hexaxyanoferat III,\r\nw ≥ 99%.

\r\n\r\n

4.2.12. Dung dịch kali\r\nhexaxyanoferat III,  = 10 g/l.

\r\n\r\n

4.2.13. Dung dịch kali\r\nhexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất trước cột),  = 0,4\r\ng/l.

\r\n\r\n

Pha loãng 2,0 ml dung dịch\r\nhexaxyanoferat (4.2.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.2.9) đến 50 ml. Chuẩn\r\nbị dung dịch này trong ngày phân tích.

\r\n\r\n

4.2.14. Dung dịch kali\r\nhexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất sau cột),  =\r\n0,5g/l.

\r\n\r\n

Pha loãng 2,5 ml dung dịch\r\nhexaxyanoferat (4.2.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.2.10) đến 50 ml.

\r\n\r\n

4.2.15. Enzym tách phospho,\r\ncó khả năng thủy phân thiamin liên kết từ thực phẩm.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Taka-Diataza1)^\r\nđã được sử dụng để xác định các dữ liệu về độ chụm.

\r\n\r\n

4.2.16. Dung dịch natri axetat,\r\nc(CH₃COONa.3H₂O) = 2,5 mol/l.

\r\n\r\n

4.2.17. Dung dịch natri axetat,\r\nc(CH₃COONa.3H₂O) = 0,5 mol/l.

\r\n\r\n

4.2.18. Pha động HPLC

\r\n\r\n

Các ví dụ về các hỗn hợp thích hợp\r\nvới các phần thể tích ví dụ như từ 10% đến 50% metanol (4.2.1) trong nước hoặc\r\nsử dụng phosphat hoặc dung dịch đệm axetat được nêu trong Phụ lục C. Khả năng\r\nsử dụng các tác nhân kết cặp ion cũng được nêu trong Phụ lục C.

\r\n\r\n

4.2.19. Dung dịch đệm phosphat\r\n(pH = 3,5), c(KH₂PO₄) = 9,0 mmol/l.

\r\n\r\n

4.2.20. Tetraetylamoniclorua,\r\nw(C₈H₂₀NCl) ≥ 98%.

\r\n\r\n

4.2.21. Natri heptansulfonat,\r\nw(C₇­H₁₅NaO₃S) ≥ 98%.

\r\n\r\n

4.2.22. Dung dịch đệm axatat\r\n(pH = 4,0), c(CH₃COOH) = 50 mmol/l.

\r\n\r\n

4.3. Chất chuẩn

\r\n\r\n

4.3.1. Yêu cầu chung

\r\n\r\n

Thiamin clorua hydroclorua có thể\r\nlấy được từ nhiều nhà cung cấp. Độ tinh khiết của các chất chuẩn thiamin có thể\r\nkhác nhau, do đó có thể cần phải xác định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng\r\nđo phổ UV (xem 4.4.4).

\r\n\r\n

4.3.2. Thiamin clorua\r\nhydroclorua, w(C₁₂H_17­ClN₄OS.HCl) ≥ 99%.

\r\n\r\n

4.3.3. Thiamin monophosphat\r\nclorua, w(C₁₂H₁₇­ClN₄O₄PS) ≥\r\n98%.

\r\n\r\n

4.3.4. Thiamin pyrophosphat\r\nclorua (cocarboxylaza), w(C₁₂H₁₉ClN₄O₇P₂S)\r\n≥ 98%.

\r\n\r\n

4.4. Dung dịch gốc

\r\n\r\n

4.4.1. Thiamin clorua\r\nhydroclorua, ρ(C₁₂H₁₇ClN₄OS.HCl)  0,1 mg/ml

\r\n\r\n

Hòa tan một lượng chính xác của\r\nchất chuẩn thiamin clorua hydroclorua (4.3.2) trong một thể tích xác định của\r\ndung môi thích hợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn vitamin B₁ trong 100\r\nml axit clohydric (4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được bốn tuần ở nhiệt\r\nđộ + 4^oC.

\r\n\r\n

4.4.2. Thiamin monophosphat,\r\nρ(C₁₂H₁₇ClN₄O₄PS)  0,1 mg/ml

\r\n\r\n

Hòa tan một lượng chính xác của\r\nchất chuẩn monophosphat (4.3.3) trong một thể tích xác định của dung môi thích\r\nhợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn monophosphat trong 100 ml axit clohydric\r\n(4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được bốn tuần ở nhiệt độ - 20 ^oC.

\r\n\r\n

4.4.3. Thiamin pyrophosphat,\r\nρ(C₁₂H₁₉ClN₄O₇P₂S)  0,1 mg/ml

\r\n\r\n

Hòa tan một lượng chính xác của\r\nchất chuẩn pyrophosphat (4.3.4) trong một thể tích xác định của dung môi thích\r\nhợp, ví dụ như 10 mg chất chuẩn pyrophosphat trong 100 ml axit clohydric\r\n(4.2.6).

\r\n\r\n

4.4.4. Kiểm tra nồng độ

\r\n\r\n

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc\r\nthiamin clorua hydroclorua (4.4.1) bằng dung dịch axit clohydric (4.2.6) trong\r\nbình định mức 100 ml đến vạch. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 247\r\nnm trong cuvet 1 cm dựa vào dung dịch axit clohydric (4.2.6) trong cuvet đối\r\nchứng sử dụng máy đo phổ UV (5.2). Tính nồng độ khối lượng, ρ, bằng microgram\r\ntrên mililit dung dịch gốc, sử dụng công thức (1):

\r\n\r\n

                            (1)

\r\n\r\n

Trong đó

\r\n\r\n

 là\r\ngiá trị hấp thụ của dung dịch ở bước sóng cực đại khoảng 247 nm;

\r\n\r\n

421 là hệ số hấp thụ  của thiamin clorua hydroclorua trong\r\naxit clohydric 0,1 mol/l (xem [7]);

\r\n\r\n

10 là hệ số pha loãng.

\r\n\r\n

4.5. Dung dịch chuẩn

\r\n\r\n

4.5.1. Thiamin clorua\r\nhydroclorua, ρ(C₁₂H₁₇ClN₄OS.HCl)  0,1 μg/ml đến 10 μg/ml

\r\n\r\n

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml\r\ndung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua (4.4.1) cho vào bình định mức 100 ml\r\nvà pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric\r\n(4.2.6). Dung dịch này có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ^oC,\r\nnơi tối.

\r\n\r\n

4.5.2. Thiamin monophosphat,\r\nρ(C₁₂H₁₇ClN₄O₄PS)  1 μg/ml đến 10 μg/ml

\r\n\r\n

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml\r\ndung dịch gốc monophosphat (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng\r\nđến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch\r\nnày có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ^oC ở nơi tối.

\r\n\r\n

4.5.3. Thiamin pyrophosphat,\r\nρ(C₁₂H₁₉ClN₄O₇P₂S)  1 μg/ml đến 10 μg/ml

\r\n\r\n

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml\r\ndung dịch gốc pyrophosphat (4.4.3) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng\r\nđến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ như axit clohydric (4.2.6). Dung dịch\r\nnày có thể ổn định được 1 tháng ở nhiệt độ 4 ^oC ở nơi tối.

\r\n\r\n

5. Thiết bị,\r\ndụng cụ

\r\n\r\n

5.1. Yêu cầu chung

\r\n\r\n

Sử dụng các thiết bị phòng thử\r\nnghiệm thông thường và cụ thể như sau:

\r\n\r\n

5.2. Máy đo phổ UV

\r\n\r\n

Có thể đo các độ hấp thụ ở các bước\r\nsóng xác định.

\r\n\r\n

5.3. Thiết bị hấp áp lực hoặc\r\nlàm nóng

\r\n\r\n

Dùng thiết bị áp lực cho mục đích\r\ntách chiết, ví dụ như kiểu nồi hấp áp lực, có bộ phận ghi nhiệt độ và áp suất,\r\nbộ phận đốt nóng bằng điện hoặc nồi cách thủy.

\r\n\r\n

5.4. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu\r\nnăng cao

\r\n\r\n

Gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu,\r\ndetector huỳnh quang có các bước sóng phát xạ và kích thích đã cài đặt, ví dụ\r\nnhư 420 nm và 366 nm, tương ứng (xem Phụ lục C) và hệ thống đánh giá như bộ\r\ntích phân.

\r\n\r\n

5.5. Cột HPLC

\r\n\r\n

5.5.1. Yêu cầu chung

\r\n\r\n

Có thể sử dụng các cột hoặc cỡ hạt\r\ncó kích cỡ khác với qui định trong tiêu chuẩn này. Các thông số riêng cần phù\r\nhợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Chuẩn mực thực\r\nhiện đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải đường nền của các chất\r\nphân tích có liên quan²⁾.

\r\n\r\n

5.5.2. Ôxy hóa trước cột

\r\n\r\n

Cột phân tích, ví dụ như Lichropher^®\r\n60 RP Select B2), cỡ hạt 5 μm, đường kính từ 4,0 mm đến\r\n4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm.

\r\n\r\n

5.5.3. Ôxy hóa sau cột

\r\n\r\n

Cột phân tích, ví dụ như Supeco^®\r\nLC-18-DB ²⁾, cỡ hạt 5 μm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ\r\n100 mm đến 250 mm.

\r\n\r\n

5.6. Thiết bị lọc

\r\n\r\n

Lọc pha động cũng như lọc dung dịch\r\nmẫu thử qua bộ lọc màng, ví dụ như 0,45 μm trước khi sử dụng hoặc bơm sẽ kéo\r\ndài tuổi thọ của cột.

\r\n\r\n

5.7. Bơm phản ứng sau cột và ống\r\ndẫn xuất

\r\n\r\n

Hệ thống phân phối thuốc thử thích\r\nhợp là ống nối kiểu chữ T và ống dẫn xuất (ví dụ như 10 m x 0,33 mm).

\r\n\r\n

6. Cách tiến\r\nhành

\r\n\r\n

6.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu

\r\n\r\n

Đồng hóa mẫu thử. Nghiền thô nguyên\r\nliệu trong máy nghiền thích hợp và trộn lại. Cần thực hiện các biện pháp như\r\nlàm nguội sơ bộ để tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian dài.

\r\n\r\n

6.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

\r\n\r\n

6.2.1. Tách chiết

\r\n\r\n

Cân một lượng mẫu thử thích hợp từ\r\n2 g đến 10 g, chính xác đến mg, cho vào bình nón. Thêm một thể tích xác định từ\r\n60 ml đến 200 ml dung dịch axit clohydric (4.2.6) hoặc axit sulfuric (4.2.7).\r\npH của dung dịch này không được lớn hơn 3,0. Đậy nắp bình bằng mặt kính đồng hồ\r\nvà hấp áp lực ở 121 ^oC trong 30 min hoặc làm nóng ở 100 ^oC\r\ntrong 60 min.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Dữ liệu từ nghiên cứu\r\nBCR cho thấy rằng có thể áp dụng một dải rộng các điều kiện đối với việc thủy\r\nphân bằng axit (nhiệt độ từ 95^oC đến 130 ^oC, thời gian từ\r\n15 min đến 60 min). Nhiệt độ cao hơn thì thời gian ngắn hơn.

\r\n\r\n

6.2.2. Xử lý bằng enzym

\r\n\r\n

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ\r\nphòng, chỉnh chính xác pH tối ưu cho enzym bằng dung dịch natri axetat (4.2.16)\r\nhoặc (4.2.17) và thêm một lượng thích hợp enzym tách phospho (4.2.15) vào mẫu.\r\nỦ hỗn hợp trong một khoảng thời gian và nhiệt độ tối ưu đối với enzym sử dụng.\r\nSau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, dùng nước cất hoặc dung môi thích hợp để\r\nchuyển dung dịch vào bình định mức tránh ánh sáng và pha loãng đến thể tích xác\r\nđịnh (V_e).

\r\n\r\n

Đối với mỗi enzyme sử dụng, cần\r\nkiểm tra pH tối ưu, nhiệt độ ủ và thời gian ủ.

\r\n\r\n

Để đảm bảo khử phospho tối ưu, bước\r\nxử lý bằng enzyme cần được kiểm tra bằng các mẫu đã xử lý với thiamin\r\nmonophosphat clorua (4.3.3) hoặc thiamin pyrophosphat clorua (4.3.4) và vật\r\nliệu tương tự trong ống mẫu làm mẫu thử. Vật liệu này phải là chất chuẩn đã\r\nđược xác nhận.

\r\n\r\n

Nếu sử dụng Taka-Diastaza để khử\r\nphosphat thì lượng thiamin có khả năng đưa vào bằng enzym cần được tính đến\r\ntrong tính toán kết quả.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH 1: Để xác định dữ liệu về\r\nđộ chụm trong tiêu chuẩn này, Taka-Diastaza¹⁾ đã được sử dụng để khử\r\nphospho dưới các điều kiện sau đây. Dịch chiết đã được điều chỉnh đến pH = 4,0\r\nvới natri axetat (4.2.16) hoặc (4.2.17) và đã bổ sung 100 mg Taka-Diastaza trên\r\ngam mẫu. Hỗn hợp này được ủ ở 37 ^oC đến 46 ^oC trong 16 h\r\nđến 24 h.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH 2: Việc khử phospho phụ\r\nthuộc vào chất nền của mẫu và enzyme đã sử dụng. Việc khử phospho có thể thực\r\nhiện trong một thời gian ngắn, xem [8].

\r\n\r\n

6.2.3. Oxy hóa thiamin về\r\nthiocrom

\r\n\r\n

6.2.3.1. Oxy hóa trước cột

\r\n\r\n

Dùng pipet lấy 1 ml mẫu thử đã xử\r\nlý bằng enzym (6.2.2), dung dịch chuẩn (4.5.1) hoặc dung dịch trắng cho vào\r\nbình cầu hoặc lọ thích hợp, thêm 1 ml dung dịch hexaxyanoferat kiềm (4.2.13).\r\nLắc dung dịch mẫu thử trong thời gian qui định (ví dụ: 10s), để yên trong\r\nkhoảng thời gian qui định (ví dụ: 1 min) và tiếm lên hệ thống HPLC pha đảo (xem\r\nBảng C.1).

\r\n\r\n

Cách khác, dung dịch đã oxy hóa có\r\nthể được chiết vào 1,5 ml isobutanol (4.2.3) và có thể bơm dịch chiết (ví dụ\r\nbằng H₃PO₄). Để loại bỏ các hợp chất gây nhiễu và bảo vệ\r\ncột HPLC thì nên trung hòa hoặc tiến hành làm sạch bằng chiết pha rắn (xem\r\n[5]).

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Việc chuyển hóa thiamin\r\nthành thiocrom có thể bị ức chế bởi các chất có mặt (ví dụ như polyphenol)\r\ntrong một số loại thực phẩm. Hiện tượng này thường gặp trong các thực phẩm chứa\r\ncacao, cũng có thể thấy trong một số thực phẩm khác. Nếu nghi ngờ có hiện tượng\r\nnày thì nên kiểm tra độ thu hồi của phương pháp bằng cách xử lý dịch chiết mẫu\r\nbằng một thể tích thích hợp của dung dịch chuẩn thiamin trước phản ứng oxy hóa.\r\nNếu độ thu hồi quá thấp thì nên tiến hành làm sạch dịch chiết mẫu sử dụng resin\r\ntrao đổi ion hoặc sử dụng HPLC có oxy hóa sau cột.

\r\n\r\n

6.2.3.2. Nhận dạng bằng oxy hóa\r\ntrước cột

\r\n\r\n

Bơm các thể tích thích hợp giống\r\nnhau của các dung dịch hiệu chuẩn cũng như các dung dịch mẫu vào hệ thống HPLC.\r\nNhận dạng thiocrom bằng so sánh thời gian lưu của các pic riêng lẻ trong sắc ký\r\nđồ thu được từ dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn. Việc thêm các chất chuẩn\r\nvào dung dịch mẫu thử cũng có thể nhận dạng được pic.

\r\n\r\n

Việc tách và định lượng được chứng\r\nminh là thỏa mãn nếu các điều kiện thực nghiệm sau đây đã được thực hiện (xem\r\nthêm Hình A.1 và Phụ lục C về các điều kiện HPLC thay thế).

\r\n\r\n

Pha tĩnh: Lichrospher^® RP\r\nSelect B, 5 μm, 250 mm x 4,0 mm

\r\n\r\n

Pha động: Metanol (4.2.1): đệm\r\naxetat (4.2.22)

\r\n\r\n

Tốc độ dòng: 0,7 ml/min

\r\n\r\n

Thể tích bơm: 20 μl

\r\n\r\n

Phát hiện: Huỳnh quang: bước sóng\r\nkích thích là 366 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm.

\r\n\r\n

6.2.3.3. Ôxy hóa sau cột

\r\n\r\n

Oxy hóa thiamin về thiocrom sử dụng\r\nphản ứng sau cột với dung dịch hexaxyanoferat (4.2.14). Thêm liên tục (ví dụ:\r\n0,3 ml/min) thuốc thử dẫn xuất qua ống nối kiểu chữ T cho vào dịch rửa giải\r\nHPLC để tạo thành thiocrom.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Việc oxy hóa sau cột bị\r\nảnh hưởng ví dụ như nồng độ natri hydroxit. Các nồng độ cao hơn trong dung dịch\r\ndẫn xuất có thể được bù bởi tốc độ bơm thấp hơn và ngược lại.

\r\n\r\n

6.2.3.4. Nhận dạng bằng oxy hóa\r\nsau cột

\r\n\r\n

Bơm các thể tích thích hợp giống\r\nnhau của các dung dịch hiệu chuẩn cũng như các dung dịch mẫu vào hệ thống HPLC.\r\nNhận dạng thiamin bằng so sánh thời gian lưu của các pic riêng lẻ trong sắc ký\r\nđồ thu được từ dung dịch mẫu thử và dung dịch thử chuẩn. Việc thêm các chất\r\nchuẩn vào dung dịch mẫu thử cũng có thể nhận dạng được pic.

\r\n\r\n

Việc tách và định lượng được chứng\r\nminh là thỏa mãn nếu các điều kiện thực nghiệm sau đây đã được thực hiện (xem\r\nthêm Hình A.2 và Phụ lục C về các điều kiện HPLC thay thế).

\r\n\r\n

Pha tĩnh: Supelco^®\r\nLC-18-DB, 5 μm, 250 mm x 4,6 mm

\r\n\r\n

Pha động: Metanol (4.2.1): đệm\r\nphosphat (4.2.19), chứa 1 g/l tetraetylamoni-clorua (4.2.20) và 5 mmol/l natri\r\nheptanesulfonat (4.2.21), (35:65)

\r\n\r\n

Tốc độ dòng: 1,0 ml/min

\r\n\r\n

Thể tích bơm: 20 μl

\r\n\r\n

Thuốc thử sau cột: dung dịch kali\r\nhexaxyanoferat III kiềm (4.2.14)

\r\n\r\n

Tốc độ dòng thuốc thử: 0,3 ml/min

\r\n\r\n

Phát hiện: Huỳnh quang: bước sóng\r\nkích thích là 368 mm; bước sóng phát xạ là 440 nm.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Việc phân tích một số\r\nmẫu, ví dụ như thịt lợn nguyên liệu có thể cho pic bổ sung của\r\n1-hydroxy-thiamin hoặc 2 (1-hydroxyetyl) thiamin trong sắc đồ xem [10] và [11].

\r\n\r\n

6.3. Phép xác định

\r\n\r\n

Tiến hành xác định bằng ngoại\r\nchuẩn, xác định diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu và so sánh các kết quả\r\nvới các giá trị tương ứng của chất chuẩn có các chiều cao pic hoặc diện tích\r\npic gần giống nhất, hoặc sử dụng đường chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tính của việc\r\nhiệu chuẩn.

\r\n\r\n

7. Tính toán

\r\n\r\n

Tính theo đường chuẩn hoặc sử dụng\r\nchương trình thích hợp của bộ tích phân hoặc sử dụng quy trình đã đơn giản hóa\r\nsau đây. Tính khối lượng vitamin B₁, w, biểu thị theo thiamin clorua\r\nhydroclorua, bằng mg/100 g mẫu, theo công thức sau đây:

\r\n\r\n

\r\n\r\n

Trong đó:

\r\n\r\n

A_ts là diện tích pic\r\nhoặc chiều cao pic của thiocrom thu được với dung dịch mẫu thử, tính bằng đơn\r\nvị chiều cao hoặc diện tích;

\r\n\r\n

A_st  là diện tích pic\r\nhoặc chiều cao pic của thiocrom thu được với dung dịch thử chuẩn, tính bằng đơn\r\nvị chiều cao hoặc diện tích;

\r\n\r\n

V_e là thể tích dung dịch\r\nmẫu thử (6.2.2), tính bằng mililít.

\r\n\r\n

ρ là nồng độ khối của thiamin\r\nclorua hydroclorua trong dung dịch thử chuẩn (4.5.1), tính bằng microgram trên\r\nmililít;

\r\n\r\n

m_s là khối lượng của\r\nmẫu, tính bằng gam;

\r\n\r\n

100 là hệ số để tính hàm lượng trên\r\n100 g;

\r\n\r\n

1000 là hệ số chuyển đổi μg/100 g\r\nthành mg/100 g.

\r\n\r\n

Báo cáo kết quả vitamin B₁\r\nbằng mg/100 g được biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua. Nếu cần phải biểu\r\nthị kết quả theo thiamin (C₁₂H₁₇ClN₄OS) thì\r\nnhân kết quả với hệ số 0,892.

\r\n\r\n

8. Độ chụm

\r\n\r\n

8.1. Yêu cầu chung

\r\n\r\n

Dữ liệu về độ chụm của các phương\r\npháp HPLC khác nhau để xác định thiamin được thiết lập năm 1996 bởi nghiên cứu\r\nso sánh quốc tế do Chương trình của Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm và Đo chuẩn\r\nthực hiện trên mẫu bột mì (CRM 121), bột sữa (CRM 421), rau hỗn hợp (CRM 485)\r\nvà gan lợn đông khô (CRM 487). Nghiên cứu này đã cung cấp thông tin về thống kê\r\nnhư trong Phụ lục B.

\r\n\r\n

8.2. Độ lặp lại

\r\n\r\n

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết\r\nquả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do\r\nmột người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn,\r\nkhông quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

\r\n\r\n

Các giá trị đối với thiamin clorua\r\nhydroclorua là:

\r\n\r\n

Bột mì:                 = 0,452 mg/100 g                           r\r\n= 0,043 mg/100 g

\r\n\r\n

Bột sữa:               = 0,645 mg/100 g                           r\r\n= 0,071 mg/100 g

\r\n\r\n

Rau hỗn hợp:        = 0,295 mg/100 g                           r\r\n= 0,039 mg/100 g

\r\n\r\n

Gan lợn:               = 0,807 mg/100 g                           r\r\n= 0,088 mg/100 g

\r\n\r\n

8.3. Độ tái lập

\r\n\r\n

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết\r\nquả thử riêng rẽ, thu được bởi hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu\r\nthử giống hệt nhau, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.\r\nCác giá trị đối với thiamin clorua hydroclorua là:

\r\n\r\n

Bột mì:                 = 0,452 mg/100 g                           R\r\n= 0,190 mg/100 g

\r\n\r\n

Bột sữa:               = 0,645 mg/100 g                           R\r\n= 0,243 mg/100 g

\r\n\r\n

Rau hỗn hợp:        = 0,295 mg/100 g                           R\r\n= 0,178 mg/100 g

\r\n\r\n

Gan lợn:               = 0,807 mg/100 g                           R\r\n= 0,623 mg/100 g

\r\n\r\n

9. Báo cáo thử\r\nnghiệm

\r\n\r\n

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ ít\r\nnhất các thông tin sau đây:

\r\n\r\n

a) mọi thông tin cần thiết để nhận\r\nbiết đầy đủ về mẫu;

\r\n\r\n

b) phương pháp thử đã dùng hoặc\r\nviện dẫn tiêu chuẩn này;

\r\n\r\n

c) ngày và phương pháp lấy mẫu đã\r\nsử dụng (nếu biết);

\r\n\r\n

d) tên và chữ ký của người phân\r\ntích;

\r\n\r\n

e) ngày nhận mẫu;

\r\n\r\n

f) kết quả thu được và đơn vị biểu\r\nthị;

\r\n\r\n

g) chi tiết quan sát được trong khi\r\nthử nghiệm;

\r\n\r\n

h) mọi chi tiết thao tác không qui\r\nđịnh trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các có thể ảnh hưởng\r\ntới kết quả.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

Phụ lục A

\r\n\r\n

(tham\r\nkhảo)

\r\n\r\n

Các ví dụ về sắc đồ HPLC

\r\n\r\n

\r\n\r\n

Pha tĩnh: Lichrospher^®\r\nRP Select B, 5 μm, 250 mm x 4,0 mm

\r\n\r\n

Pha động: Metanol (4.2.1): đệm\r\naxetat (4.2.22) (40:60)

\r\n\r\n

Tốc độ dòng: 0,7 ml/min

\r\n\r\n

Thể tích bơm: 20 μl

\r\n\r\n

Phát hiện: Huỳnh quang: bước sóng\r\nkích thích là 366 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm.

\r\n\r\n

Hình\r\n1 – Ví dụ về tách bằng HPLC của thiamin theo chuẩn thiocrom sử dụng dẫn xuất\r\ntrước cột

\r\n\r\n

\r\n\r\n

Pha tĩnh: Purospher^® RP\r\nC18, được đậy nắp ở cuối, 5 μm, 250 mm x 4,6 mm

\r\n\r\n

Pha động: Metanol (4.2.1): đệm\r\nphosphat, pH 3,5, c(NH₄H₂PO₄) = 10 mmol/l,\r\nchứa 1 g/l tetraetylamoniclorua (4.2.20) và 5 mmol/l natri heptanesulfonat\r\n(4.2.21), (35:70)

\r\n\r\n

Tốc độ dòng: 1,5 ml/min

\r\n\r\n

Thể tích bơm: 3 μl

\r\n\r\n

Thuốc thử sau cột: dung dịch kali\r\nhexaxyanoferat III kiềm (4.2.14)

\r\n\r\n

Tốc độ dòng thuốc thử: 0,3 ml/min

\r\n\r\n

Phát hiện: Huỳnh quang: bước sóng\r\nkích thích là 365 nm; bước sóng phát xạ là 435 nm.

\r\n\r\n

Hình\r\n2 – Ví dụ về tách bằng HPLC của chuẩn thiamin sử dụng dẫn xuất sau cột trong\r\nrau diếp (a), cơm (b) và thịt lợn luộc (c)

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

Phụ lục B

\r\n\r\n

(Tham\r\nkhảo)

\r\n\r\n

Dữ liệu về độ chụm

\r\n\r\n

Theo những chỉ dẫn nghiên cứu chứng\r\nnhận EU SMT, các dữ liệu đưa ra trong Bảng B.1 đã được xác định trong một phép\r\nthử liên phòng thử nghiệm [9]. Viện nghiên cứu thực phẩm, Norwich, UK thay mặt\r\ncho Ủy ban EU tham gia nghiên cứu này. Các dữ liệu đưa ra trong Bảng B.2 và\r\nBảng B.3 đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm của Pháp\r\n[5].

\r\n\r\n

Bảng\r\nB.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với bột mì thô, sữa bột, rau hỗn hợp và gan lợn

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Mẫu \r\n	\r\n CRM\r\n 121 \r\n (bột\r\n mì thô) \r\n	\r\n CRM\r\n 421 \r\n (sữa\r\n bột) \r\n	\r\n CRM\r\n 485 \r\n (rau\r\n hỗn hợp) \r\n	\r\n CRM\r\n 487 \r\n (gan\r\n lợn) \r\n
\r\n Năm thử nghiệm \r\n	\r\n 1996 \r\n	\r\n 1996 \r\n	\r\n 1996 \r\n	\r\n 1996 \r\n
\r\n Số phòng thử nghiệm \r\n	\r\n 13 \r\n	\r\n 14 \r\n	\r\n 12 \r\n	\r\n 15 \r\n
\r\n Số lượng mẫu \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 2 \r\n
\r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau\r\n khi trừ ngoại lệ \r\n	\r\n 13 \r\n	\r\n 14 \r\n	\r\n 12 \r\n	\r\n 15 \r\n
\r\n Số ngoại lệ \r\n	\r\n 0 \r\n	\r\n 0 \r\n	\r\n 0 \r\n	\r\n 0 \r\n
\r\n Số kết quả được chấp nhận \r\n	\r\n 65 \r\n	\r\n 70 \r\n	\r\n 58 \r\n	\r\n 72 \r\n
\r\n Giá trị trung bình  (mg/100 g) \r\n	\r\n 0,452 \r\n	\r\n 0,645 \r\n	\r\n 0,295 \r\n	\r\n 0,807 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn của giá trị trung\r\n bình, mg/100 g \r\n	\r\n 0,054 \r\n	\r\n 0,086 \r\n	\r\n 0,039 \r\n	\r\n 0,182 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr \r\n	\r\n 0,015 \r\n	\r\n 0,025 \r\n	\r\n 0,012 \r\n	\r\n 0,031 \r\n
\r\n Hệ số biến thiên lặp lại \r\n	\r\n 3,2% \r\n	\r\n 3,8% \r\n	\r\n 4,2% \r\n	\r\n 3,9% \r\n
\r\n Giá trị lặp lại r [r = 2,83 x sr],\r\n mg/100g \r\n	\r\n 0,043 \r\n	\r\n 0,071 \r\n	\r\n 0,039 \r\n	\r\n 0,088 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n (mg/100 g) \r\n	\r\n 0,053 \r\n	\r\n 0,085 \r\n	\r\n 0,063 \r\n	\r\n 0,182 \r\n
\r\n Hệ số biến thiên tái lập \r\n	\r\n 11,8% \r\n	\r\n 13,2% \r\n	\r\n 13,3% \r\n	\r\n 22,6% \r\n
\r\n Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR),\r\n mg/100 g \r\n	\r\n 0,190 \r\n	\r\n 0,243 \r\n	\r\n 0,178 \r\n	\r\n 0,623 \r\n

\r\n\r\n

Bảng\r\nB.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với thức ăn đóng chai dạng dung dịch, thức ăn cho\r\ntrẻ em, sữa bột, bột trộn trái cây và nấm

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Mẫu \r\n	\r\n Dung\r\n dịch thức ăn trong chai \r\n	\r\n Thức\r\n ăn cho trẻ em \r\n	\r\n Sữa\r\n bột \r\n	\r\n Bột\r\n trộn trái cây \r\n	\r\n Nấm \r\n
\r\n Năm nghiên cứu \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n
\r\n Số phòng thử nghiệm \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n
\r\n Số lượng mẫu \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n
\r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau\r\n khi trừ ngoại lệ \r\n	\r\n 8 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n
\r\n Số ngoại lệ \r\n	\r\n 2 \r\n	\r\n 0 \r\n	\r\n 0 \r\n	\r\n 0 \r\n	\r\n 0 \r\n
\r\n Số kết quả được chấp nhận \r\n	\r\n 16 \r\n	\r\n 20 \r\n	\r\n 20 \r\n	\r\n 20 \r\n	\r\n 20 \r\n
\r\n Giá trị trung bình  (mg/100 g) \r\n	\r\n 0,11 \r\n	\r\n 0,2 \r\n	\r\n 0,56 \r\n	\r\n 1,04 \r\n	\r\n 1,31 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr \r\n	\r\n 0,01 \r\n	\r\n 0,02 \r\n	\r\n 0,04 \r\n	\r\n 0,07 \r\n	\r\n 0,12 \r\n
\r\n Hệ số biến thiên lặp lại \r\n	\r\n 7% \r\n	\r\n 8% \r\n	\r\n 7% \r\n	\r\n 7% \r\n	\r\n 9% \r\n
\r\n Giá trị lặp lại r [r = 2,83 x sr],\r\n mg/100g \r\n	\r\n 0,02 \r\n	\r\n 0,05 \r\n	\r\n 0,1 \r\n	\r\n 0,2 \r\n	\r\n 0,34 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n (mg/100 g) \r\n	\r\n 0,04 \r\n	\r\n 0,04 \r\n	\r\n 0,08 \r\n	\r\n 0,19 \r\n	\r\n 0,17 \r\n
\r\n Hệ số biến thiên tái lập \r\n	\r\n 32% \r\n	\r\n 21% \r\n	\r\n 16% \r\n	\r\n 19% \r\n	\r\n 13% \r\n
\r\n Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR),\r\n mg/100 g \r\n	\r\n 0,1 \r\n	\r\n 0,12 \r\n	\r\n 0,25 \r\n	\r\n 0,55 \r\n	\r\n 0,48 \r\n

\r\n\r\n

Bảng\r\nB.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với ngũ cốc, bột sôcôla và thức ăn bổ sung

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Mẫu \r\n	\r\n Ngũ\r\n cốc \r\n	\r\n Ngũ\r\n cốc \r\n	\r\n Bột\r\n sôcôla \r\n	\r\n Thức\r\n ăn bổ sung \r\n
\r\n Năm nghiên cứu \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n	\r\n 1995 \r\n
\r\n Số phòng thử nghiệm \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n	\r\n 10 \r\n
\r\n Số lượng mẫu \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n
\r\n Số phòng thử nghiệm còn lại sau\r\n khi trừ ngoại lệ \r\n	\r\n 9 \r\n	\r\n 9 \r\n	\r\n 9 \r\n	\r\n 9 \r\n
\r\n Số ngoại lệ \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n	\r\n 1 \r\n
\r\n Số kết quả được chấp nhận \r\n	\r\n 18 \r\n	\r\n 18 \r\n	\r\n 18 \r\n	\r\n 18 \r\n
\r\n Giá trị trung bình  (mg/100 g) \r\n	\r\n 1,42 \r\n	\r\n 2,95 \r\n	\r\n 1,55 \r\n	\r\n 486 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn lặp lại, sr \r\n	\r\n 0,06 \r\n	\r\n 0,18 \r\n	\r\n 0,13 \r\n	\r\n 39 \r\n
\r\n Hệ số biến thiên lặp lại \r\n	\r\n 4% \r\n	\r\n 6% \r\n	\r\n 8% \r\n	\r\n 8% \r\n
\r\n Giá trị lặp lại r [r = 2,83 x sr],\r\n mg/100g \r\n	\r\n 0,16 \r\n	\r\n 0,49 \r\n	\r\n 0,36 \r\n	\r\n 111 \r\n
\r\n Độ lệch chuẩn tái lập, sR,\r\n (mg/100 g) \r\n	\r\n 0,27 \r\n	\r\n 0,41 \r\n	\r\n 0,28 \r\n	\r\n 75 \r\n
\r\n Hệ số biến thiên tái lập \r\n	\r\n 19% \r\n	\r\n 14% \r\n	\r\n 19% \r\n	\r\n 15% \r\n
\r\n Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR),\r\n mg/100 g \r\n	\r\n 0,75 \r\n	\r\n 1,16 \r\n	\r\n 0,8 \r\n	\r\n 212 \r\n

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

Phụ lục C

\r\n\r\n

(tham\r\nkhảo)

\r\n\r\n

Hệ thống HPLC thay thế

\r\n\r\n

Việc tách và định lượng được chứng\r\nminh là thích hợp nếu áp dụng các điều kiện về sắc ký như sau [9]:

\r\n\r\n

Bảng\r\nC.1 – Điều kiện HPLC thay thế

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Pha\r\n cố định \r\n	\r\n Kích\r\n thước cột \r\n mm\r\n x mm \r\n	\r\n Pha\r\n động \r\n (V:V) \r\n	\r\n Sự\r\n tách sóng (Ex/Em) \r\n nm \r\n	\r\n Lưu\r\n lượng ml/min \r\n	\r\n Kiểu\r\n oxi hóa \r\n
\r\n Radial silica® 10 μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Etanol/dung dịch đệm phosphat pH\r\n = 7,4 \r\n c(K2HPO4) =\r\n 0,1 mol/l (50:50) \r\n	\r\n F:\r\n 365/435 \r\n	\r\n 3,0 \r\n	\r\n PCa \r\n
\r\n Supelco® LC-18-DB 5 μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Metanol/dung dịch đệm phosphat pH\r\n = 3,5 c(K2HPO4) = 9 mmol/l chứa tetraetylamoniumclorua,\r\n ρ(C8H20NCl) = 1 g/l và natri heptansulfonat, c(C7H15NaO3S)\r\n = 5 mmol/l (35:65) \r\n	\r\n F:\r\n 368/420 \r\n	\r\n 1,0 \r\n	\r\n PC \r\n
\r\n Lichrospher® RB 18 5\r\n μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Metanol/natri hexansulfonat, c(C6H13NaO3S.H2O)\r\n = 1 mmol/l, pH = 3,0 (70:30) \r\n	\r\n F:\r\n 375/435 \r\n	\r\n 1,5 \r\n	\r\n PC \r\n
\r\n Eurospher® 100 – C18 5\r\n μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Natri dihydrophosphat, c(NaH2PO4)\r\n = 10 mmol/l): natri perclorat, c(NaClO4) = 0,15 mol/l (50:50) \r\n	\r\n F:\r\n 375/435 \r\n	\r\n 1,0 \r\n	\r\n PC \r\n
\r\n Lichrospher® RP Select\r\n B 5 μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Metanol/dung dịch đệm axetat pH =\r\n 4,0, c(CH­3­COONa) = 50 mmol/l (40:60) \r\n	\r\n F:\r\n 366/435 \r\n	\r\n 0,7 \r\n	\r\n PRCb \r\n
\r\n μ-Bondapak® radial C18\r\n 5 μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Metanol/dung dịch đệm axetat pH =\r\n 4,5, c(CH­3­COONa) = 0,5 mmol/l (40:60) \r\n	\r\n F:\r\n 366/435 \r\n	\r\n 0,8 \r\n	\r\n PRC \r\n
\r\n Spherisorb® ODS2 5 μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Metanol/dung dịch đệm phosphat pH\r\n = 4,0, c(KH2PO4) = 0,1 mol/l (70:30) \r\n	\r\n F:\r\n 375/435 \r\n	\r\n 1,0 \r\n	\r\n PRC \r\n
\r\n Lichrospher® RP 18 10\r\n μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Kali dihydrophosphat, c(KH2PO4)\r\n = 10 mmol/l/dimetyl formamit (80:20) \r\n	\r\n F:\r\n 368:440 \r\n	\r\n 1,5 \r\n	\r\n PRC \r\n
\r\n Hamilton® PRP-1 5 μm \r\n	\r\n 150\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Metanol/nước (40:60); pH được\r\n điều chỉnh tới 4,5 bằng axit axetic \r\n	\r\n F:\r\n 366/435 \r\n	\r\n 1,0 \r\n	\r\n PRC \r\n
\r\n Hamilton® PRP-1 5 μm \r\n	\r\n 150\r\n x 4,1 \r\n	\r\n Metanol/nước (35:65); pH = 9,0\r\n được điều chỉnh bằng amoniac, w(NH3) = 25% \r\n	\r\n F:\r\n 366/435 \r\n	\r\n 1,0 \r\n	\r\n PRC \r\n
\r\n Hypersil® NH2APS\r\n 2 5 μm \r\n	\r\n 250\r\n x 4,6 \r\n	\r\n Diclometan/metanol (95:5) \r\n	\r\n F:\r\n 365/435 \r\n	\r\n 1,0 \r\n	\r\n PRC \r\n
\r\n a PC = Dẫn xuất sau\r\n cột. \r\n b PRC = Dẫn xuất trước\r\n cột. \r\n

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

\r\n\r\n

[1] Bognár, A.: Bcstimmung von\r\nRiboflavin und Thiamin in Lebensrnitteln mil Hilfe dor Hochleistungs-\r\nflussigkeitschromatographie (HPLC) Deutsche Lebensm. Rundschau 77. 1981.\r\n431-436.

\r\n\r\n

[2] Hasselmann. C. Franck, D.,\r\nGrimm. P.. Diop, P.A. and Soules. C: High-peiiormance liquid chromatographic\r\nanalysis of thiamin and riboflavin in dietic foods. J. Micronutr. Anal. 5.\r\n1989. 269-279.

\r\n\r\n

[3] Bognar, A.: Determination of\r\nvitamin B1 in food by High-Performance-Liquid-Chromatography and post-column\r\nderivatization. Fresenius J. Anal. Chem. 343.1992. 155-56.

\r\n\r\n

[4] Hagg. M. and Kumpulainen. J.:\r\nThiamin and riboflavin contents in domestic and imported cereal products in\r\nFinland. J. Food Comp. Anal. 6, 1993. 299-306.

\r\n\r\n

[5] Arella, P., Lahely, S.,\r\nBourguignon, J. B. and Hasselmann, C.: Liquid chromatographic determination of\r\nvitamin B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem 56. 1996. 81-86.

\r\n\r\n

[6] Eitenmiller, R. R. and Landen.\r\nW. O: Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press. Boca Raton.\r\nLondon, New York. Washington. D.C., 1999, 271-297.

\r\n\r\n

[7] Dawson. R.M.C.. Elliott. D C,\r\nElliot. W. H. and Jones. K.: Data lor Biochemical Research. Oxford Science\r\nPublication 3rd. ISBN 019 855299 8,1989.

\r\n\r\n

[8] Hagg. M.: Effect of various\r\ncommercially available enzymes in the liquid chromatographic determination with\r\nexternal standardization of thiamin and riboflavin in foods J. AOAC Int. 77.\r\n1994, 681-686.

\r\n\r\n

[9] Finglas, P. M., Scott., K. J..\r\nWitthoft, C. M., van den Berg, H. and de Froidmont-Gortz, I.: Ihe certification\r\nof the mass fractions of vitamins in four reference materials: Whoiomeal flour\r\n(CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilised mixed vegetables (CRM 485) and\r\nlyophilised pig's liver (CRM 487) EUR-report 18320. Office for Official\r\nPublications of the European Communities. Luxembourg, 1999.

\r\n\r\n

[10] Takasht, U. Yukiko, T., Kohei,\r\nM., Mari, T. Kaname, K.: Simultaneous determination of 2(1-\r\nhydroxyethyl)thiamin and thiamin in foods by high performance liquid\r\nchromatography with post­column derivatisation. Vitamins (Japan). 64. 1990.\r\n379-385.

\r\n\r\n

[11] Takashi, U., Yukiko, T.,\r\nKohei, M., Masako, M., Kaname, K.: Distribution and stability of 2(1-\r\nhydroxyethyl)thiamin and thiamin in foods. Vitamins (Japan). 65.1991, 249-256.

\r\n\r\n