Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4830-3:2005 (ISO 6888-3 : 2003) về Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (staphylococcus aureus và các loài khác) trên đĩa thạch – Phần 3: Phát hiện và dùng kỹ thuật đếm số có xác suất lớn nhất (MPN) để đếm số lượng nh

\r\n\r\n

TIÊU\r\nCHUẨN VIỆT NAM

\r\n\r\n

TCVN\r\n4830-3: 2005

\r\n\r\n

ISO\r\n6888-3 : 2003

\r\n\r\n

VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - \r\nPHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CÓ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE\r\n(STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC LOÀI KHÁC; TRÊN ĐĨA THẠCH - PHẦN 3: PHÁT HIỆN VÀ\r\nDÙNG KỸ THUẬT ĐẾM SỐ  CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT (MPN) ĐỂ ĐẾM SỐ LƯỢNG NHỎ
\r\nMicrobiology\r\nof\r\nfood\r\nand animal feeding stuffs\r\n- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci\r\n(Staphylococcus aureus and other species) - Part 3: Detection and\r\nMPN technique for low numbers

\r\n\r\n

Lời giới thiệu

\r\n\r\n

Do tính đa dạng của thực phẩm và thức\r\năn chăn nuôi nên phương pháp này có thể không thích hợp đến từng chi tiết cho từng\r\nsản phẩm cụ thể. Trong trường hợp này, có thể sử dụng các phương pháp khác đặc trưng\r\ncho từng sản phẩm, nếu\r\nhoàn toàn chỉ vì lý do kỹ thuật. Tuy nhiên, cần cố gắng áp dụng phương\r\npháp này khi có thể.

\r\n\r\n

Khi tiêu chuẩn này được soát xét tiếp\r\nthì cần phải tính đến mọi thông tin liên quan đến phạm vi mà phương pháp đếm\r\nđĩa này phải tuân theo và các nguyên nhân gây sai lệch so với phương pháp trong\r\ntrường hợp các sản\r\nphẩm cụ thể.

\r\n\r\n

Việc hài hoà các phương pháp thử có thể\r\nkhông thực hiện được ngay và đối với một vài nhóm sản phẩm có thể tồn tại các\r\ntiêu chuẩn quốc tế và/hoặc tiêu chuẩn quốc gia mà không phù hợp với tiêu chuẩn\r\nnày. Trong trường hợp có sẵn tiêu chuẩn quốc tế cho sản phẩm cần thử nghiệm\r\nthì phải tuân theo tiêu chuẩn đó. Hy vọng rằng khi các tiêu chuẩn như thế được\r\nsoát xét, thì chúng phải được sửa đổi để phù hợp với tiêu chuẩn này, sao cho cuối\r\ncùng chỉ còn các sai lệch với phương pháp đếm đĩa này là các lý do kỹ thuật được\r\nthừa nhận.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

VI SINH VẬT\r\nTRONG THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI -  PHƯƠNG PHÁP\r\nĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CÓ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE (STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ CÁC\r\nLOÀI KHÁC; TRÊN ĐĨA THẠCH - PHẦN 3: PHÁT HIỆN VÀ\r\nDÙNG KỸ THUẬT ĐẾM SỐ  CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT\r\n(MPN) ĐỂ ĐẾM SỐ LƯỢNG NHỎ
\r\nMicrobiology\r\nof\r\nfood\r\nand animal feeding stuffs\r\n- Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci\r\n(Staphylococcus aureus and other species) - Part 3:\r\nDetection and MPN technique for low numbers

\r\n\r\n

1 Phạm vi áp dụng

\r\n\r\n

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp phát hiện và định lượng\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch bằng kỹ thuật\r\nđếm số có xác suất lớn nhất (MPN). Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

\r\n\r\n

- Các sản phẩm dùng cho con người và thức\r\năn chăn nuôi, và

\r\n\r\n

- Các mẫu môi trường trong khu vực\r\nsản xuất và xử lý thực phẩm.

\r\n\r\n

Tiêu chuẩn này được khuyến cáo áp dụng\r\ncho các sản phẩm khi ước tính tính staphylococci có mặt trong sản phẩm với số\r\nlượng nhỏ, ví dụ như các sản phẩm khô. Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase ban đầu\r\nlà các Stapylococcus\r\naureus\r\nnhưng Stapylococcus intermedius và một số chủng của Stapylococcus\r\nhyicus cũng sinh ra coagulase.

\r\n\r\n

2 Tài liệu viện dẫn

\r\n\r\n

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần\r\nthiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban\r\nhành thì áp dụng\r\nphiên bản được nêu. Đối với\r\ncác tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất,\r\nbao gồm cả các sửa đổi.

\r\n\r\n

TCVN 6507 (ISO 6887) (tất cả các phần),\r\nVi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù\r\nban đầu và các dung\r\ndịch pha loãng thập phân\r\nđể kiểm tra vi sinh vật.

\r\n\r\n

TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và các sản\r\nphẩm sữa. Chuẩn bị mẫu thử và các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh.

\r\n\r\n

TCVN 4830-1 : 2005 (ISO 6888-1 : 1999,\r\nwith amendment 1: 2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn\r\nnuôi - Phương pháp định luợng\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococuss aureus và\r\nloài khác) trên đĩa thạch. Phần 1: Kỹ thuật\r\nsử dụng môi trường thạch Baird-Parker.

\r\n\r\n

TCVN 4830-2 : 2005 (ISO 6888-2 : 1999,\r\nwith amendment 1 : 2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Phương pháp định lượng\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (Staphylococuss aureus\r\nvà loài khác) trên đĩa thạch. Phần 2: Kỹ thuật sử dụng môi trường thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ.

\r\n\r\n

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật\r\ntrong thực phẩm và trong thức ăn chăn nuôi - Nguyên tắc chung để kiểm tra vi\r\nsinh vật.

\r\n\r\n

ISO/TS 11133-1, Microbiology of food\r\nand animal feeding stuffs\r\n- Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General\r\nguidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the\r\nlaboratory (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi - Hướng dẫn chuẩn\r\nbị và tạo môi trường cấy\r\n- Phần 1. Các hướng\r\ndẫn chung về đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị\r\nmôi trường cấy\r\ntrong phòng thử nghiệm).

\r\n\r\n

ISO/TS 11133-2 ; 2003, Microbiology of\r\nfood and animal feeding stuffs\r\n- Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2:\r\nPractical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật\r\ntrong thực phẩm và thức ăn\r\nchăn nuôi\r\n-\r\nHướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy\r\n- Phần 2: Các hướng dẫn thực\r\nhành về kiểm tra tính năng của môi trường cấy).

\r\n\r\n

3 Thuật ngữ và định\r\nnghĩa

\r\n\r\n

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ\r\nvà định nghĩa sau đây:

\r\n\r\n

3.1

\r\n\r\n

staphylococci có phản ứng dương\r\ntính với coagulase (coagulase -positive staphylococci) vi khuẩn hình thành các\r\nkhuẩn lạc điển hình và/hoặc không điển hình trên bề mặt môi trường cấy chọn lọc\r\nvà cho các phản ứng dương tính với coagulase hoặc phản ứng huyết tương thỏ đặc\r\ntrưng trên thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Tiêu chuẩn này khẳng định\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase được dựa trên phản ứng dương tính\r\nvới coagulase mạnh, nhưng phải công nhận rằng một số chủng staphylococci có phản\r\nứng dương tính với coagulase nhưng cho các phản ứng dương tính với coagulase yếu.\r\nCác chủng này có thể nhầm với các vi khuẩn\r\nkhác nhưng chúng có thể được phân biệt bằng các thử nghiệm bổ sung như việc tạo\r\nra thermonucleasa (về chi tiết, xem IDF 83).

\r\n\r\n

3.2

\r\n\r\n

Định lượng\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of coagulase-positive\r\nstaphylococci)

\r\n\r\n

Việc xác định số lượng staphylococci có phản ứng\r\ndương tính với coagulase tìm thấy trong một gam hoặc một mililit mẫu khi tiến\r\nhành thử nghiệm theo phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này.

\r\n\r\n

4 Nguyên tắc

\r\n\r\n

4.1 Phương pháp phát hiện

\r\n\r\n

4.1.1 Cấy lên môi trường chọn\r\nlọc một lượng mẫu thử qui định, nếu sản phẩm ban đầu ở dạng lỏng,\r\nhoặc một lượng huyền phù qui định ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác .

\r\n\r\n

4.1.2 Ủ các ống trong môi trường kỵ khí ở 37 ^oC từ 24 h đến\r\n48 h. Sự có mặt của staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase\r\nđược chỉ thị bởi sự khử kali telurit.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, môi trường kỵ\r\nkhí thu được bằng cách rót thạch hoặc paraffin đậy lên phía trên mỗi ống, nhưng cũng có một\r\ncách khác là ủ các ống này trong bình hoặc trong tủ ấm trong các điều kiện kỵ\r\nkhí.

\r\n\r\n

4.1.3 Cấy lên bề mặt môi trường\r\nBaird-Parker đặc chọn lọc các khuẩn lạc lấy từ các ống dương tính giả định\r\n(4.1.2) sau 24 h và tất cả các ống còn lại sau 48 h.

\r\n\r\n

4.1.4. Tất cả các ống được cấy\r\nở 37 ^oC từ 24 h đến\r\n48 h. Sự có mặt của staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase\r\nđược chỉ thị bởi sự khử kali telurit và phản ứng với lòng đỏ trứng.

\r\n\r\n

4.1.5 Các khuẩn lạc điển hình và/hoặc\r\nkhông điển hình được khẳng\r\nđịnh bằng phản ứng với coagulase.

\r\n\r\n

4.1.6 Cách khác, có thể cấy\r\nlên bề mặt thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ, sau khi ủ ấm thích hợp, sự có mặt của staphylococci có phản ứng dương\r\ntính với coagulase được chỉ thị bởi các khuẩn lạc cho thấy có phản ứng với fibrinogen huyết\r\ntương thỏ\r\nđặc trưng.

\r\n\r\n

4.1.7 Kết quả là "có mặt"\r\nhay "không có mặt"\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong x g hay x ml sản phẩm.

\r\n\r\n

4.2 Phương pháp định lượng

\r\n\r\n

4.2.1 Các dãy dung dịch pha\r\nloãng sản phẩm được cấy vào môi trường cấy lỏng chọn lọc.

\r\n\r\n

4.2.2 Các ống được ủ trong\r\nđiều kiện kỵ khí ở 37 ^oC từ 24 h đến 48 h. Sự có mặt của staphylococci có phản ứng\r\ndương tính với coagulase giả định được chỉ thị bởi sự khử kali telurit.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Trong tiêu chuẩn này, môi\r\ntrường kỵ khí thu được bằng cách rót thạch hoặc paraffin đậy lên\r\nphía trên mỗi ống, nhưng\r\ncũng có một cách khác là ủ các ống này trong bình hoặc trong tủ ấm trong các điều\r\nkiện kỵ khí.\r\n

\r\n\r\n

4.2.3 Cấy lên bề mặt môi\r\ntrường\r\nBaird-Parker đặc chọn lọc các khuẩn lạc lấy từ các ống dương tính giả định\r\n(4.2.2) sau 24 h và tất cả các ống còn lại sau 48 h.

\r\n\r\n

4.2.4 Ủ các ống này ở 37 ^oC từ 24 h đến\r\n48 h. Sự có mặt của staphylococci giả định có phản ứng dương tính với coagulase\r\nđược chỉ thị bởi sự khử kali telurit và phản ứng với lòng đỏ trứng.

\r\n\r\n

4.2.5 Các khuẩn lạc điển hình\r\nvà/hoặc không điển hình được khẳng định bằng phản ứng với coagulase.

\r\n\r\n

4.2.6 Cách khác, có thể cấy\r\nlên bề mặt thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ, sau khi ủ ấm thích hợp, sự có mặt của staphylococci có phản ứng\r\ndương tính với coagulase được chỉ thị bởi các khuẩn lạc cho thấy có phản ứng\r\nvới fibrinogen huyết\r\ntương thỏ đặc trưng.

\r\n\r\n

4.2.7 Số có xác suất lớn nhất\r\ncủa staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong một gam hay trong\r\nmột mililit sản phẩm tính được bằng\r\ncách đối chiếu với các bảng số có xác suất lớn nhất cho các độ pha loãng khẳng định (4 2.5\r\nhoăc 4.2.6)

\r\n\r\n

5 Dịch pha loãng và\r\nmôi trường cấy

\r\n\r\n

Đối với phòng thử nghiệm,\r\nxem TCVN 6404 (ISO 7218).

\r\n\r\n

Các hóa chất được sử dụng để\r\nchuẩn bị môi trường cấy\r\nvà thuốc thử phải có chất lượng tinh khiết phân tích.

\r\n\r\n

5.1 Dịch pha loãng

\r\n\r\n

Xem phần tương ứng của TCVN 6507 (ISO\r\n6887), hoặc TCVN 6263 (ISO 8261), hoặc tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm\r\ncần kiểm tra.

\r\n\r\n

5.2 Môi trường Giolitti và\r\nCantoni cải biến

\r\n\r\n

5.2.1 Môi trường\r\ncơ bản

\r\n\r\n

5.2.1.1 Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n   \r\n	\r\n Môi trường nồng độ kép \r\n	\r\n Môi trường nồng độ\r\n đơn \r\n
\r\n Pepton từ casein \r\n	\r\n 20,0 g \r\n	\r\n 10,0 g \r\n
\r\n Cao thịt \r\n	\r\n 10,0 g \r\n	\r\n 5,0 g \r\n
\r\n Cao men \r\n	\r\n 10,0 g \r\n	\r\n 5,0 g \r\n
\r\n Liti clorua \r\n	\r\n 10,0 g \r\n	\r\n 5,0 g \r\n
\r\n Mannitol \r\n	\r\n 40,0 g \r\n	\r\n 20,0 g \r\n
\r\n Natri clorua \r\n	\r\n 10,0 g \r\n	\r\n 5,0 g \r\n
\r\n Glyxin \r\n	\r\n 2,4 g \r\n	\r\n 1,2 g \r\n
\r\n Natri pyruvat \r\n	\r\n 6,0 g \r\n	\r\n 3,0 g \r\n
\r\n Polyoxyetylen sorbitan mono-oleat (Tween 80) \r\n	\r\n 2,0 g \r\n	\r\n 1,0 g \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 1 000 ml \r\n	\r\n 1 000 ml \r\n

\r\n\r\n

5.2.1.2 Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hoà tan các thành phần trong nước, bằng\r\ncách đun nóng và khuấy, nếu cần, để thu được dung dịch hoà tan hoàn toàn. Làm\r\nnguội đến nhiệt độ phòng và chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH cuối cùng là\r\n6,9 ± 0,2, nếu cần.

\r\n\r\n

Phân phối môi trường với các lượng thích hợp vào các ống\r\nnghiệm có kích thước phù hợp (ví dụ: đối với môi trường nồng độ đơn,\r\ndùng ống 16 mm x 160 mm, đối\r\nvới môi trường nồng\r\nđộ kép thì dùng ống 20 mm x 200 mm).

\r\n\r\n

Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực\r\nở 121 ^oC.

\r\n\r\n

5.2.2 Dung dịch kali\r\ntelurit

\r\n\r\n

5.2.2.1 Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Kali telurit 2) (K2TeO3) \r\n	\r\n 1,0 g \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 100 ml \r\n

\r\n\r\n

5.2.2.2 Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hoà tan kali telurit trong nước bằng\r\ncách đun nóng rất nhẹ.

\r\n\r\n

Bột phải dễ tan. Nếu có mặt chất không\r\ntan màu trắng trong nước; thì loại bỏ kali\r\ntelurit.

\r\n\r\n

Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 mm để khử trùng.

\r\n\r\n

Dung dịch có thể bảo quản được tối đa\r\nmột tháng ở nhiệt độ 3 ^oC ± 2 ^oC.

\r\n\r\n

Loại bỏ dung dịch nếu có kết tủa màu\r\ntrắng.

\r\n\r\n

5.2.3 Môi trường hoàn chỉnh

\r\n\r\n

Ngay trước khi sử dụng, đun nóng môi trường cơ bản\r\n(5.2.1) 15 phút ở 100 ^oC để đuổi hết không khí.

\r\n\r\n

Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 ^oC đến 47 ^oC và bằng kỹ\r\nthuật vô trùng cho thêm vào mỗi ống dung dịch kali telurit (5.2.2): 0,1 ml đối với\r\nmôi trưòng nồng độ đơn và\r\n0,2 ml đối với môi trường nồng độ kép.

\r\n\r\n

5.2.4 Thử tính năng để đảm bảo chất\r\nlượng môi trường cấy

\r\n\r\n

Để xác định tính chọn lọc và năng suất,\r\nxem ISO/TS 11133-1. Bảng 1 cho thấy chuẩn cứ thử nghiệm tính năng của môi trường\r\nGiolitti và Cantoni cải biến.

\r\n\r\n

Bảng 1 - Chuẩn\r\ncứ thử nghiệm tính năng của môi trường Giolitti và Cantoni cải biến

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Chức năng \r\n	\r\n Chế độ ủ \r\n	\r\n Các chủng\r\n kiểm tra \r\n	\r\n Môi trường\r\n chuẩn \r\n	\r\n Phương pháp kiểm tra \r\n	\r\n Chuẩn cứ \r\n
\r\n Năng suất \r\n	\r\n 37 oC trong 48 h \r\n	\r\n Staphylococcus\r\n aureus\r\n ATCC 6538 P hoặc Staphylococcus\r\n aureus ATCC 25923 cộng với chủng cạnh tranh (E.coli ATCC 8732 hoặc\r\n 25922), hoặc chủng tương tự được đăng ký trong các bộ khác \r\n	\r\n   \r\n	\r\n Bán định lượng \r\n	\r\n > 10 khuẩn\r\n lạc, trên môi trường chọn lọc \r\n
\r\n Tính chọn loc \r\n	\r\n 37 oC trong 48h \r\n	\r\n Escherichia coli ATCC 25922\r\n hoặc 8739 hoặc chủng tương tự được đăng ký trong các bộ khác \r\n	\r\n TSA \r\n	\r\n Bán định lượng \r\n	\r\n Không mọc trên\r\n môi trường không chọn lọc \r\n

\r\n\r\n

5.3 Môi trường thạch (20 g/l)

\r\n\r\n

5.3.1 Thành phần

\r\n\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n

\r\n Thạch \r\n	\r\n 15 g đến 20 g3) \r\n
\r\n Nước \r\n	\r\n 1 000 ml \r\n

\r\n\r\n

5.3.2 Chuẩn bị

\r\n\r\n

Hoà tan thạch trong nước bằng cách đun sôi và khử trùng\r\n15 phút trong nồi hấp áp lực ở 121 ^oC.

\r\n\r\n

Làm nguội đến nhiệt độ từ 44 ^oC đến 47 ^oC trước khi sử\r\ndụng. Rót vào các ống nghiệm có dung tích thích hợp. Bảo quản theo TCVN 6404 (ISO\r\n7218).

\r\n\r\n

5.4 Môi trường thạch\r\nBaird-Parker

\r\n\r\n

5.4.1 Thành phần và chuẩn bị

\r\n\r\n

Xem 5.3 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO\r\n6888-1 : 1999, with amendment 1: 2003).

\r\n\r\n

5.4.2 Thử tính năng để đảm bảo chất lượng\r\nmôi trường cấy

\r\n\r\n

Để xác định tính chọn lọc\r\nvà năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các chuẩn cứ, xem Bảng B.1 của ISO/TS\r\n11133-2.

\r\n\r\n

5.5 Môi trường thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ (xem [6] và [7])

\r\n\r\n

5.5.1 Thành phần và chuẩn bị

\r\n\r\n

Xem 5.3 của TCVN 4830-2 : 2005 (ISO\r\n6888-2: 1999, with amendment 1: 2003).

\r\n\r\n

5.5.2 Thử tính năng để đảm\r\nbảo chất lượng môi trường cấy

\r\n\r\n

Để xác định tính chọn lọc\r\nvà năng suất, xem\r\nISO/TS 11133-1. Đối với các chuẩn cứ, xem Bảng B.1 của ISO/TS 11133-2.

\r\n\r\n

5.6 Môi trường canh thang não - tim\r\n(Brain-heart infusion broth)

\r\n\r\n

5.6.1 Thành phần và chuẩn bị

\r\n\r\n

Xem 5.4 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO\r\n6888-1: 1999, with amendment 1 : 2003).

\r\n\r\n

5.6.2 Thử tính năng để đảm\r\nbảo chất lượng\r\nmôi trường cấy

\r\n\r\n

Để xác định tính chọn lọc và năng suất, xem ISO/TS 11133-1. Đối với các\r\nchuẩn cứ, xem Bảng B.4 của ISO/TS 11133-2.

\r\n\r\n

5.7 Huyết tương thỏ

\r\n\r\n

Xem 5.5 của TCVN 4830-1 : 2005 (ISO\r\n6888-1: 1999, with amendment 1: 2003).

\r\n\r\n

6 Thiết bị và dụng cụ

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Có thể dùng dụng cụ thuỷ tinh sử dụng\r\nmột lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng\r\ncó các đặc tính thích hợp.

\r\n\r\n

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của\r\nphòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] và cụ thể là:

\r\n\r\n

6.1 Tủ ấm, có thể hoạt\r\nđộng ở 37 ^oC ± 1 ^oC.

\r\n\r\n

6.2 Tủ sấy hoặc lò sấy,\r\nđược thông gió bằng đối lưu, có thể duy trì nhiệt độ từ 37 ^oC đến 55 ^oC. Có thể sử dụng\r\ntủ quạt gió.

\r\n\r\n

6.3 Đĩa Petri, vô trùng.

\r\n\r\n

6.4 Que cấy vòng, bằng\r\nplatin-iridi, niken-crôm hoặc chất dẻo, đường kính khoảng 3 mm, hoặc các que cấy\r\nvòng 10 ml vô trùng sử\r\ndụng một lần và các kim cấy sâu bằng chất liệu tương tự.

\r\n\r\n

6.5 Ống nghiệm, có dung\r\ntích thích hợp (ví dụ: 16 mm x 160 mm, 20 mm x 200 mm và 10 mm x 75 mm).

\r\n\r\n

6.6 Pipet chia độ, có dung\r\ntích danh định 1 ml, được chia vạch 0,1 ml và có lỗ xả với đường kính hợp lý.

\r\n\r\n

6.7 Nồi cách thủy, có thể hoạt\r\nđộng ở nhiệt độ từ\r\n44 ^oC đến 47 ^oC và ở 37 ^oC.

\r\n\r\n

6.8 Dao, để cắt thạch.

\r\n\r\n

6.9 Bình kỵ khí.

\r\n\r\n

7 Lấy mẫu

\r\n\r\n

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận\r\nđược đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt\r\nquá trình vận chuyển\r\nvà bảo quản.

\r\n\r\n

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu\r\nchuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các bên có\r\nliên quan tự\r\nthoả\r\nthuận về vấn đề này.

\r\n\r\n

8 Chuẩn bị mẫu thử

\r\n\r\n

Việc chuẩn bị mẫu thử theo các phần\r\nthích hợp của TCVN 6507 (ISO 6887), hoặc TCVN 6263 (ISO 8261) hoặc tiêu chuẩn\r\nriêng cho sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng thì các bên liên quan tự\r\nthoả thuận với nhau về vấn đề này.

\r\n\r\n

9 Cách tiến hành

\r\n\r\n

9.1 Phương pháp phát hiện

\r\n\r\n

9.1.1 Phần mẫu thử và huyền\r\nphù ban đầu

\r\n\r\n

Xem các phần tương ứng của TCVN 6507\r\n(ISO 6887) tuỳ thuộc vào sản phẩm có liên quan hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

\r\n\r\n

Để chuẩn bị huyền phù ban đầu, cho 1\r\nml hoặc 1 g sản phẩm vào 9 ml hoặc 9 g môi trường Giolitti và Cantoni cải biến\r\nnồng độ đơn (5.2) hoặc 10 ml hoặc 10 g vào 10 ml hoặc 10 g môi trường Giolitti\r\nvà Cantoni cải biến nồng độ kép. Đối với các thể tích lớn hơn của các phần mẫu\r\nthử, thêm x ml hoặc x g vào 9 x ml hoặc 9 x g môi trường Giolitti\r\nvà Cantoni cải biến nồng độ\r\nđơn đã được đuổi khí và đã được bổ sung kali telurit, và có thể tích không khí\r\nnhỏ nhất trong bình hoặc trong vật chứa. Rót cẩn thận thạch (5.3) hoặc paraffin\r\nphủ lên trên môi trường, được làm nguội đến nhiệt độ từ 44 ^oC đến 47 ^oC và cho đông\r\nđặc lại để tạo thành lớp hàn kín.

\r\n\r\n

9.1.2 Tăng sinh

\r\n\r\n

Ủ (xem 6.1) dung dịch huyền phù ban đầu (9.1.1)\r\ntrong 24 h ± 2 h ở 37 ^oC. Nếu bị đen\r\nhoặc có kết tủa đen thì cấy truyền\r\nnhư trong 9.1.3. Nếu không hiện màu đen thì ủ tiếp 24 h ± 2 h và cấy truyền\r\nnhư trong 9.1.3 (kể cả xuất hiện hoặc không xuất hiện màu đen hoặc kết tủa\r\nđen).

\r\n\r\n

9.1.3 Cấy truyền từ các ống tăng sinh

\r\n\r\n

Bằng cách vô trùng, tháo bỏ lớp thạch\r\nhoặc paraffin phía trên, sử dụng dao vô trùng (6.8) để cắt (xem chú thích trong\r\n4.1.2) thành bốn phần theo chiều dọc. Nếu cần, chèn dao vào sát thành theo đường\r\ncong của ống thuỷ tinh\r\nđể tách lớp phủ này. Lắc mạnh ống để lớp phủ vỡ thành mảnh nhỏ rơi xuống đáy ống và đảm\r\nbảo còn nguyên huyền phù dịch cấy.

\r\n\r\n

Dùng que cấy vòng vô\r\ntrùng (6.4), lấy một\r\nvòng đầy từng môi trường chọn lọc dàn lên bề mặt các đĩa thạch Baird Parker (5.4) riêng biệt hoặc các đĩa thạch\r\nfibrinogen huyết tương thỏ (5.5) để thu được các khuẩn lạc phân lập.

\r\n\r\n

Lật ngược các đĩa đã chuẩn bị và đặt chúng vào tủ\r\nấm (6.1) để ở 37 ^oC trong 24 h ± 2 h và 48 h ± 2 h.

\r\n\r\n

9.2 Phương pháp định lượng

\r\n\r\n

9.2.1 Phần mẫu thử và huyền\r\nphù ban đầu

\r\n\r\n

Xem các phần thích hợp của TCVN 6507\r\n(ISO 6887) tuỳ thuộc vào sản phẩm có liên quan hoặc TCVN 6263 (ISO 8261).

\r\n\r\n

9.2.2 Cấy

\r\n\r\n

Lấy ba ống môi trường nồng độ kép, đã\r\nđuổi khí và đã bổ sung kali telurit (5.2.3). Chuyển vào mỗi ống 10 ml mẫu thử dạng\r\nlỏng hoặc 10 ml dung dịch pha\r\nloãng ban đầu (tức là 1 g mẫu) của các sản phẩm dạng\r\nkhác.

\r\n\r\n

Lấy ba ống môi trường nồng\r\nđộ đơn, đã đuổi khí và bổ sung kali telurit (5.2.3). Chuyển vào mỗi ống 1 ml mẫu thử dạng\r\nlỏng hoặc 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu (tức là 0,1 g mẫu) của các sản phẩm\r\ndạng khác.

\r\n\r\n

Đối với mỗi độ pha loãng tiếp theo (tức\r\nlà 10^-1, 10^-2 và 10^-3 đối với sản\r\nphẩm dạng lỏng hoặc 10^-2, 10^-3 hoặc 10^-4 đối với các sản phẩm\r\ndạng khác), tiến hành như mô tả ở trên, sử dụng pipet vô trùng mới cho mỗi độ\r\npha loãng.

\r\n\r\n

Chuẩn bị đủ một số lượng\r\ncác dung dịch pha loãng để đảm bảo rằng độ pha loãng cuối cùng đủ để cho ba kết\r\nquả âm tính.

\r\n\r\n

Trộn cẩn thận chất cấy và môi trường, trong mỗi\r\ntrường hợp tránh để lẫn không khí vào.

\r\n\r\n

Cẩn thận rót một lớp thạch (5.3), đã được làm\r\nnguội đến nhiệt độ từ 44 ^oC đến 47 ^oC lên trên môi trường trong mỗi ống đã cấy và\r\nđể cho đặc lại tạo\r\nthành lớp hàn kín.

\r\n\r\n

9.2.3. Ủ

\r\n\r\n

Ủ (xem 6.1) các ống nghiệm đựng môi trường nồng\r\nđộ kép và môi trường nồng độ đơn (9.2.2) đã cấy, ở 37 ^oC trong 24 h ± 2 h. Cấy truyền các ống\r\nnghiệm cho thấy bị đen hoặc có kết tủa đen như đã chỉ ra trong 9.5.

\r\n\r\n

Ủ tiếp các ống còn lại trong 24 h ± 2 h và cấy\r\ntruyền tất cả các ống như trong 9.1.3 (kể cả các ống có kết tủa đen hoặc không có kết\r\ntủa đen sau 48 h ± 2 h).

\r\n\r\n

9.2.4. Cấy truyền

\r\n\r\n

9.3 Chọn đĩa vả giải\r\nthích kết quả

\r\n\r\n

9.3.1 Môi trường thạch\r\nBaird-Parker

\r\n\r\n

9.3.1.1 Chọn các khuẩn lạc

\r\n\r\n

Sau khi ủ các đĩa (9.1.3 hoặc 9.2.4)\r\n24 h, đánh dấu vào đáy các đĩa các vị trí của bất kỳ khuẩn lạc điển hình nào có\r\nmặt.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH 1: Các khuẩn lạc\r\nđiển hình có màu đen\r\nhoặc màu xám, bóng và lồi (đường kính từ 1 mm đến 1,5 mm sau khi ủ trong 24\r\nh, và có đường kính từ 1,5 mm\r\nđến 2,5 mm sau khi ủ\r\n48 h) và được bao quanh bằng một vùng trong rõ rệt, cũng có thể là mờ từng phần.\r\nSau khi ủ trong ít nhất 24 h, có thể xuất hiện một vòng màu trắng đục tiếp giáp với khuẩn lạc .

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH 2: Các khuẩn lạc không điển\r\nhình cùng kích cỡ như khuẩn lạc điển hình và có thể có một trong các hình thái sau.

\r\n\r\n

a) Các khuẩn lạc đen bóng có hoặc không có\r\nrìa trắng hẹp; không có vùng trong hoặc hầu như không nhìn thấy và không có\r\nvòng trắng đục hoặc rất khó nhìn thấy.

\r\n\r\n

b) Các khuẩn lạc màu xám không có vùng\r\ntrong.

\r\n\r\n

Các khuẩn lạc không điển hình được\r\nhình thành chủ yếu do các chủng staphylococci có phản ứng dương tính với\r\ncoagulase nhiễm vào sản phẩm, ví dụ: các sản phẩm sữa, tôm và các bộ phận của vật\r\nnuôi. Chúng thường ít khi được hình thành do các chủng\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase bị nhiễm trong các sản phẩm khác.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH 3: Các khuẩn lạc khác là tất cả các\r\nkhuẩn lạc còn lại có khả năng có mặt trên các đĩa mà không cho thấy biểu hiện bên ngoài điển\r\nhình hoặc không điển hình như đã mô tả trong Chú thích 1 và\r\nChú thích 2, và được coi là hệ vi khuẩn nền.

\r\n\r\n

Ủ lại (xem 6.1) tất cả các đĩa ở 37 ^oC thêm 24 h +\r\n2 h và đánh dấu bất kỳ khuẩn lạc điển hình nào mới. Đồng thời cũng đánh dấu bất\r\nkỳ khuẩn lạc không điển hình nào có mặt.

\r\n\r\n

9.3.1.2 Khẳng định

\r\n\r\n

Từ bề mặt của mỗi khuẩn lạc\r\nđã chọn (9.3.1.1), dùng kim cấy vô trùng lấy một phần và chuyển vào ống hoặc lọ\r\nđựng môi trường canh\r\nthang não-tim (5.6).

\r\n\r\n

Ủ (xem 6.1) ở 37 ^oC trong 24 h ±\r\n2 h.

\r\n\r\n

Bằng kỹ thuật vô trùng, lấy 0,1 ml chủng\r\ncấy cho vào 0,3 ml huyết tương thỏ (5.7) (trừ khi nhà sản xuất qui định các lượng\r\nkhác) đựng trong các ống vô trùng có kích thước thích hợp (ví dụ 10 mm x 75 mm)

\r\n\r\n

Nghiêng ống, kiểm tra sự kết dính của\r\nhuyết tương sau khi ủ từ 4 h đến 6 h, và nếu phép thử là âm tính thì kiểm tra lại\r\nsau khi ủ 24 h ± h, hoặc kiểm\r\ntra theo thời gian ủ được\r\nnhà sản xuất qui định.

\r\n\r\n

Các phép thử coagulase được coi là\r\ndương tính nếu các chủng cấy sinh ra tại ít nhất các phản ứng coagulase 3 ⁺ theo hướng dẫn\r\nđánh dấu (kẻ vạch) trong Hình 1. Các phản ứng từ 1⁺ đến 2⁺ được coi là\r\ntrung gian.

\r\n\r\n

Về kiểm tra âm tính, đối với mỗi mẻ\r\nhuyết tương, thêm 0,1 ml môi trường canh thang não-tim vô trùng (5.6)\r\nvào một lượng huyết tương thỏ (5.7) đã được khuyến cáo và ủ nhưng không cấy.\r\nViệc kiểm tra huyết tương không có dấu hiệu nào của sự kết dính thì phép thử là\r\nhợp lệ.

\r\n\r\n

Đánh dấu dương tính mỗi ống có ít nhất\r\nmột khuẩn lạc được khẳng định là dương tính với coagulase.

\r\n\r\n

\r\n\r\n

- âm tính: không có bằng chứng hình thành\r\nfibrrin.

\r\n\r\n

1 + dương tính: kết dính nhỏ không có tổ chức

\r\n\r\n

2 + dương tính: kết dính nhỏ có tổ chức

\r\n\r\n

3 + dương tính: kết dính nhiều có tổ chức

\r\n\r\n

4 + dương tính: toàn bộ kết dính và không dịch\r\nchuyển khi ống bị lật ngược

\r\n\r\n

Hình 1 - Đánh\r\ndấu các phản ứng thử nghiệm\r\nvới coagulase

\r\n\r\n

9.3.2 Môi trường thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ

\r\n\r\n

Sau khi ủ 24 h ± 2 h, và ủ tiếp 24 h nếu\r\ncần, staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase hình thành các\r\nkhuẩn lạc nhỏ màu đen hoặc màu xám (hoặc thậm chí màu trắng) được bao quanh bởi\r\nvòng sáng kết tủa dấu hiệu cho hoạt tính coagulase. Khi bắt đầu ủ, các khuẩn lạc\r\nProteus, có thể cho thấy vẻ bên ngoài giống với các khuẩn lạc staphylococci có\r\nphản úng dương tính với coagulase. Tuy nhiên sau khi ủ 24 h hoặc 48 h chúng có\r\nthể phát triển thành khuẩn lạc mọc rộng có màu nâu đậm hoặc nâu nhạt do đó\r\ncó thể phân biệt được với\r\nvi khuẩn staphylococci.

\r\n\r\n

Phép thử là dương tính khi\r\ncó mặt ít nhất một khuẩn\r\nlạc chỉ\r\nthị hoạt tính coagulase được thấy

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Vi thạch fibrinogen huyết\r\ntương thỏ được dựa\r\ntrên phản ứng\r\ncoagulase, nên không cần thiết phải khẳng định hoạt\r\ntính này.

\r\n\r\n

10 Biểu thị kết quả

\r\n\r\n

10.1 Phương pháp phát hiện

\r\n\r\n

Theo giải thích các kết quả, ghi lại sự\r\ncó mặt hoặc không có mặt staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase\r\ntrong phần mẫu thử, theo khối lượng tính bằng gam hoặc theo thể tích tính bằng\r\nmililit của mẫu thử.

\r\n\r\n

10.2 Phương pháp định\r\nlượng

\r\n\r\n

10.2.1 Chọn các\r\nđộ pha loãng

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Huyền phù ban đầu và mẫu thử,\r\nnếu ở dạng lỏng được coi là dung dịch pha loãng.

\r\n\r\n

Đối với mỗi độ pha loãng đã được cấy vào môi trường cấy lỏng\r\nchọn lọc (9.1.2 và 9.2.2), ghi lại số lượng ống nghiệm cho thấy có mặt\r\nstaphylococci có phản ứng dương tính với coagulase đã được khẳng định bằng phép\r\nthử thạch Baird-Parker (9.3.1) hoặc sự có mặt các khuẩn lạc với các phản ứng\r\ndương tính với coagulase trên môi trường thạch fibrinogen huyết tương\r\nthỏ (9.3.2). Chỉ rõ đó là các ống dương tính.

\r\n\r\n

Chọn ba độ pha loãng liên tiếp theo\r\n9.4 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996) và xác định chỉ số có xác suất lớn\r\nnhất (MPN) [xem TCVN 6404 (ISO 7218)]

\r\n\r\n

10.2.2 Tính toán

\r\n\r\n

Xem 9.4 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218\r\n: 1996).

\r\n\r\n

11. Độ chụm

\r\n\r\n

Như đã biết, các sai lệch\r\nlớn trong các kết quả có thể xảy ra với kỹ thuật MPN. Các giới hạn tin cậy\r\nqui định được dựa hoàn toàn trên sự phân bố ngẫu nhiên các kết quả. Các nguyên\r\nnhân gây ra sai lệch khác đôi khi có thể rất quan trọng, nhưng không đề cập\r\ntrong kỹ thuật MPN. Để tính đến các ảnh hưởng này, sử dụng các phạm trù trong bảng\r\nB.2 của TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218 : 1996). Chúng tổng kết các tổ hợp ống\r\ntheo khả năng xuất hiện của chúng.

\r\n\r\n

CHÚ THÍCH: Môt nghiên cứu cộng tác quốc tế (xem [3])\r\ntrên các mẫu sữa khô cho\r\nthấy, sử dụng kỹ thuật\r\nMPN giống như mô\r\ntả trong tiêu chuẩn này, thì trong 75 % các trường hợp chênh lệch giữa các kết\r\nquả của hai phép thử độc lập nhỏ hơn 1,25 lần so với trung bình cộng của hai kết\r\nquả. Chênh lệch lớn nhất quan sát được giữa các kết quả của hai phép thử độc lập\r\nlà 1.94 lần so với trung bình cộng của hai kết quả.

\r\n\r\n

12 Báo cáo thử nghiệm

\r\n\r\n

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ:

\r\n\r\n

a) Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu\r\nthử,

\r\n\r\n

b) Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

\r\n\r\n

c) Phương pháp thử nghiệm đã dùng (phương\r\npháp phát hiện hoặc phương pháp định lượng; môi trường đã sử dụng), viện dẫn\r\ntiêu chuẩn này;

\r\n\r\n

d) Mọi chi tiết thao tác không được quy định\r\ntrong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tuỳ ý cũng như các sự cố bất kỳ\r\nmà có thể ảnh hưởng đến kết quả;

\r\n\r\n

e) kết quả thu được, chỉ rõ phương pháp\r\nbiểu thị đã sử dụng.

\r\n\r\n

 

\r\n\r\n

THƯ\r\nMỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

\r\n\r\n

[1] IDF 83 : 1998, Milk and milk-based products -\r\nDetection of thermonuclease produced by coagulase - positive staphylococci in\r\nmilk and milk-based products.

\r\n\r\n

[2] IDF 60 C : 1997, Milk and\r\nmilk-based products -\r\nDetection of coagulase - positive staphylococci - Most probable number\r\ntechnique.

\r\n\r\n

[3] CHOPIN, A. , MALCOLM, S. , JARVIS,\r\nG. , ASPERGER, H. , BECKERS, H.J. , BERTONA, A.M. , COMINAZZINI, C. , CARINI, S. , LODI, R.\r\n. HAHN, G. , HEESCHEN, W. , JANS,\r\nJERVIS, D.l. , LANIER, J.M. , OCONNOR, F., REA, M. , ROSSI, J. , SELIGMANN, R. , TESONE, S. . WAES, G.\r\n, MOCQUOT, G. and PIVNICK H Comparision of four media and\r\nmethods for enumerating Staphylococcus aureus in powdered milk: ICMSF methods\r\nstudies: XV, J. Food. Prot. , 48, 1985, pp. 21-27.

\r\n\r\n

[4] BAIRD - PARKER, A.C. improvide\r\ndiagnostic and selective medium for isolating coagulase positive staphylococci,\r\nJ. Applied Bacteriology, 25 (1), 1962, pp. 12-19.

\r\n\r\n

[5] SMITH, B.A and BAIRD - PARKER, A.C. The use of\r\nsulphamezathine for inhibiting Proteus spp. on Baird-Parker's isolation medium\r\nfor Staphylococcus aureus. J. Applied Bacteriology, 27 (1). 1964, pp. 78 - 82.

\r\n\r\n

[6] BECKERS, H.L et al. Evaluation of\r\npour-plate system with rabbit plasma-bovine fibrinogen agar for the enumeration of\r\nStaphylococcus auraus in food.\r\nCan. J. Microbioi. , 30, 1984, pp. 470-474.

\r\n\r\n

[7] SAWHEY. D. The toxicity of potassium tellurite\r\nto Staphylococcus aureus in rabbit plasma fibrinigen agar, J. Applied Bacteriology, 61,\r\n1996, pp, 149- 155.

\r\n\r\n